豬大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌的多重實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

劉嘉琳，劉東旭，董文龍，李國江*

(1．吉林農業大學 動物科學技術學院， 吉林 長春 130118； 2．吉林農業科技學院 動物科技學院， 吉林 吉林市 132109； 3．吉林省預防獸醫學重點實驗室， 吉林 吉林市 132109)

豬腹瀉病是導致仔豬死亡的主要原因之一，嚴重影響了飼料報酬，制約養豬業的健康發展。其中大腸桿菌、沙門菌和產氣莢膜梭菌是引起豬細菌性腹瀉病的主要病原。大腸桿菌某些致病血清型菌株可致仔豬黃白痢、豬水腫病，臨床上以腸炎、腸毒血癥為特征[1-3]；沙門菌主要感染1～4月齡豬，豬沙門菌病又名豬副傷寒,臨床上分為急性、亞急性和慢性型，急性型以敗血癥為特征，亞急性和慢性型以壞死性腸炎為特征；產氣莢膜梭菌亦稱魏氏梭菌，引起仔豬壞死性腸炎，以腸道出血為特征，表現為紅色下痢。豬細菌性腹瀉一年四季都有可能發生，既可單一感染，也可相互混合感染。因此，本試驗針對大腸桿菌irp2基因[4]、沙門菌fimY基因[5]、產氣莢膜梭菌plc基因[6]設計特異性引物和探針并優化反應條件，建立了同時檢測并區分這3種細菌的多重實時熒光定量PCR檢測方法，為這3種細菌的檢測提供了有效手段。

1 材料與方法

1.1 菌株及臨床樣品的采集多動物鏈球菌、豬鏈球菌、乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌、海氏腸球菌、綠色氣球菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌、洛菲不動桿菌、溶血曼氏桿菌、HPI+大腸桿菌、大腸桿菌標準株ATCC25922、產氣莢膜梭菌等由實驗室保存。豬糞便樣本采集于吉林地區豬場表現出腹瀉癥狀的豬，稱取100 mg置于滅菌離心管中保存于-80℃超低溫冰箱。

1.2 主要試劑及儀器糞便基因組DNA提取試劑盒，購自Solarbio；細菌基因組小量純化試劑盒、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye )、凝膠回收試劑盒、pMD18-T Vector、DH5α大腸桿菌感受態、質粒DNA 小量純化試劑盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR )等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。梯度PCR儀，購自上海皓莊儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀，購自AnalytikJena；核酸蛋白測定儀，購自Eppendorf。

1.3 引物及探針根據GenBank登錄的大腸桿菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌基因序列，針對大腸桿菌irp2基因，沙門菌fimY基因，產氣莢膜梭菌plc基因設計特異性引物及不同熒光基團標記的探針(表1)，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 大腸桿菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌特異性引物及探針序列

1.4 標準品陽性質粒的制備利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取臨床采集的糞便樣本DNA作為模板，用合成的特異性引物進行PCR擴增，回收并純化PCR產物。將pMD18-T Vector與回收純化產物連接，連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，挑取陽性克隆接種于4 mL含4 μL AMP LB液體培養基中培養，使用質粒DNA小量純化試劑盒進行重組質粒的提取并進行PCR鑒定，陽性重組質粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，結果與GenBank中相關核酸序列BLAST比對分析。測定陽性重組質粒濃度，按公式將濃度轉化為拷貝數，作為標準模板保存于-80℃超低溫冰箱備用。

拷貝數(拷貝/μL)=[ 6.02×1023×質粒濃度(mg/ L) ×10-9]/(質粒分子堿基數× 660)

1.5 反應條件的優化在RT-qPCR擴增反應體系中，將退火溫度設置為54.3,54.4,54.6,55.0,55.4,55.8,56.2,56.6,57.0,57.4,57.6和57.7℃，選擇Ct值最小的溫度作為最佳退火溫度。

將上下游引物和探針終濃度分別設置為0.1,0.2,0.3和0.4 μmol/L進行RT-qPCR擴增反應，選擇最佳終濃度。

1.6 標準曲線的建立質粒10倍梯度稀釋后，選取9.28×103～9.28×107拷貝/μL質粒混合后作為標準模板，設置3組平行對照組，利用建立的三重RT-qPCR檢測方法，繪制標準曲線。

1.7 靈敏性試驗以濃度梯度為9.28×100～9.28×107拷貝/μL的標準質粒混合后作為模板，設立陰性對照，利用建立的三重RT-qPCR檢測方法和常規PCR擴增，確定檢測方法的靈敏性。

1.8 特異性試驗使用細菌基因組小量純化試劑盒提取多動物鏈球菌、豬鏈球菌、乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌、海氏腸球菌、綠色氣球菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌、洛菲不動桿菌、溶血曼氏桿菌、HPI+大腸桿菌、大腸桿菌標準株ATCC25922、、產氣莢膜梭菌DNA。利用建立的三重RT-qPCR檢測方法以上述DNA為模板，大腸桿菌標準陽性質粒、沙門菌標準陽性質粒、產氣莢膜梭菌標準陽性質粒為陽性對照，滅菌水為陰性對照進行檢測，驗證其特異性。

1.9 重復性試驗以濃度梯度為9.28×104～9.28×106拷貝/μL的標準質粒混合后作為模板，按建立的RT-qPCR檢測方法進行組內和組間的擴增反應，每個樣本做5個重復檢測，計算Ct值的標準差及變異系數。

1.10 臨床樣品的檢測利用建立的大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR檢測方法及普通PCR對采集的糞便樣本進行檢測，比較2種方法的符合率。普通PCR反應體系如下：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye )12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，滅菌水8.5 μL。反應程序為：95℃ 2 min；95℃ 30 s，54.4℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 7 min；4℃ forever。

2 結果

2.1 標準品陽性質粒的制備提取臨床采集的糞便樣本DNA作為模板，用特異性引物進行PCR擴增，獲得大腸桿菌irp2基因(140 bp)、fimY基因(119 bp)、plc基因(115 bp)片段，與目的片段大小一致。經PCR及測序鑒定，結果顯示與預期一致(圖1)。結果表明成功構建了3種重組質粒，命名為 pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc，檢測質粒質量濃度分別為288.2,95.1,134.4 mg/L，換算成拷貝數分別為9.28×1010,3.09×1010,4.37×1010拷貝/μL。將其作為質粒標準品保存于-80℃超低溫冰箱備用。

M.DL500 DNA Marker；1.大腸桿菌(140 bp)陽性質粒； 2.沙門菌(119 bp)陽性質粒；3.產氣莢膜梭菌(115 bp)陽性質粒；4.大腸桿菌陰性對照；5.沙門菌陰性對照；6.產氣莢膜梭菌陰性對照圖1 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌電泳

2.2 RT-qPCR反應體系建立及優化三重RT-qPCR反應體系經優化確定為25 μL：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR )12.5 μL，大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌上下游引物(10 μmol/L)各0.75，1，1 μL(終濃度分別為0.3，0.4，0.4 μmol/L)，大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌探針(10 μmol/L)各1，0.75，1 μL(終濃度分別為0.4，0.3，0.4 μmol/L)，模板2 μL，滅菌水2.25 μL。反應程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，54.4℃ 30 s并收集熒光信號，39個循環(圖2)。

圖2 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR 不同退火溫度擴增曲線

2.3 標準曲線繪制將pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc質粒標準品10倍稀釋成9.28×103～9.28×107copies/μL，等比例混合均勻后取2 μL作為模板，利用大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR擴增，擴增曲線及標準曲線如圖3。結果顯示，在9.28×103～9.28×107拷貝/μL濃度范圍內，所得拷貝數(x)與Ct 值(y)的線性方程如下：大腸桿菌，y=-3.45x+35.09，R2=0.994，E=0.95；沙門菌，y=-3.35x+36.57，R2=0.997，E=0.99；產氣莢膜梭菌，y=-3.49x+34.39，R2=0.995，E=0.94，具有良好的線性關系。

A.大腸桿菌標準曲線；B.沙門菌標準曲線；C.產氣莢膜梭菌標準曲線圖3 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR 103～107 拷貝/μL濃度標準模板標準曲線

2.4 靈敏性試驗將pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc質粒標準品10倍稀釋成9.28×100～9.28×107拷貝/μL，等比例混合作為模板進行靈敏性試驗。結果顯示，在Ct值<35范圍內，此檢測方法對pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc檢測下限分別為9.28×103，3.09×10,和4.37×103拷貝/μL(圖4)，表明此檢測方法具有較好的靈敏性。

A.大腸桿菌靈敏性試驗擴增曲線；B.沙門菌靈敏性試驗擴增曲線；C.產氣莢膜梭菌靈敏性試驗擴增曲線;3.pMD18-plc；4.鼠傷寒沙門菌DNA；5.產氣莢膜梭菌DNA；6.HPI+大腸桿菌DNA圖4 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR 107 拷貝/μL～100 拷貝/μL靈敏性試驗擴增曲線

2.5 特異性試驗以多動物鏈球菌、豬鏈球菌、乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌、海氏腸球菌、綠色氣球菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌、洛菲不動桿菌、溶血曼氏桿菌、HPI+大腸桿菌、大腸桿菌標準株ATCC25922、產氣莢膜梭菌DNA為模板，pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc為陽性對照，滅菌水為陰性對照，利用建立的三重RT-qPCR檢測方法進行特異性試驗。結果表明，HPI+大腸桿菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌DNA及陽性對照出現特異性擴增曲線，其余細菌DNA及陰性對照無擴增曲線出現(圖5)，表明建立的大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR檢測方法具有良好的特異性。

1.pMD18-irp2；2.pMD18-fim Y；3.pMD18-plc；4.鼠傷寒沙門菌DNA；5.產氣莢膜梭菌DNA；6.HPI+大腸桿菌DNA；7.大腸桿菌標準株DNA；8.多動物鏈球菌；9.豬鏈球菌DNA；10.乳酸乳球菌DNA；11.金黃色葡萄球菌DNA；12.海氏腸球菌DNA；13.綠色氣球菌DNA；14.多殺性巴氏桿菌DNA；15.肺炎克雷伯菌DNA；16.洛菲不動桿菌DNA；17.溶血曼氏桿菌DNA；18.陰性對照圖5 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR 特異性試驗擴增曲線

2.6 重復性試驗將pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc質粒標準品10倍稀釋成9.28×104～9.28×106拷貝/μL，等比例混合作為模板進行重復性試驗。結果表明，組間及組內重復性試驗Ct值變異系數均在5%以下(表2)，表明此檢測方法具有較好的重復性。

表2 重復性試驗結果

2.7 臨床樣品的檢測利用所建立的多重熒光定量RT-PCR方法，對采集自吉林地區112份臨床樣品進行檢測，同時利用建立的大腸桿菌、沙門菌、產氣莢膜梭菌多重熒光定量PCR方法及普通PCR方法對相同病料進行檢測(圖6)。結果表明本試驗所建立的多重熒光定量RT-PCR比普通PCR具有更強的靈敏性，可以用于臨床檢測(表3)。臨床檢測結果中存在3種病原的相互混合感染，需要加以重視。

表3 臨床樣品檢測結果

圖6 大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌三重RT-qPCR 臨床樣品檢測

3 討論

大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌是導致仔豬細菌性腹瀉的主要病原，臨床上常出現混合感染，且細菌耐藥性增強，為臨床診斷及治療造成一定阻礙。大腸桿菌可引起仔豬黃痢及仔豬白痢，近些年HPI被認為是大腸桿菌重要的毒力因子之一,可以顯著提高大腸桿菌的致病性,其中irp2為主要標志基因,對于細菌毒力的發揮都起著至關重要的作用[7]。呂殿紅等[8]在廣東地區養殖場分離攜帶irp2基因HPI+大腸桿菌陽性率為28%，南文金等[9]在粵北地區大腸桿菌HPI相關毒力因子中檢出irp2基因陽性率為21.43%，路振香等[10]從病料樣本中分離的13株病原菌中12株均為產腸毒素大腸桿菌并且均含有HPI。沙門菌主要引起仔豬副傷寒，主要癥狀表現為頑固性下痢，糞便黃綠色水樣，2009和2012年山東省豬源沙門菌分離率為10%[11]，廣西地區11個規模化豬場采集的99份病料中分離到21株沙門菌，分離率為21%[12]。焦連國[13]在2014-2018年采集到的全國26個省市123家規模化豬場的806份樣本中分離得到沙門菌173株，分離率為21.46%，以鼠傷寒沙門菌為主，主要分布在河北、山東、湖南、湖北、重慶等省市。產氣莢膜梭菌主要引起仔豬紅痢，主要癥狀為壞死性腸炎及腸毒血癥，病程短，病死率高，王海榮[14]在從山東多地采集的來源于不同動物的689份糞便樣本中分離131株產氣莢膜梭菌，均為A型，其中豬源產氣莢膜梭菌為31株。

通過應用本試驗建立的多重熒光定量PCR檢測方法，對吉林地區規模化豬場采集的糞便樣本進行檢測，大腸桿菌irp2基因、沙門菌、產氣莢膜梭菌陽性率分別為58.9%，7.1%，7.1%，大腸桿菌及沙門菌混合感染率為1.8%，大腸桿菌及產氣莢膜梭菌混合感染率為5.4%，表明攜帶HPI的大腸桿菌在致仔豬腹瀉病原中占比越來越高，沙門菌檢出率較往年有所下降，產氣莢膜梭菌則呈上升趨勢[15]，在豬養殖中要注意消毒，預防疾病發生。

目前國內外可以同時檢測大腸桿菌、沙門菌及產氣莢膜梭菌的方法很少，本試驗建立了一種可以同時檢測這3種病原的多重實時熒光定量PCR檢測方法，具有較好的特異性、敏感性和重復性，耗時不超過3 h，適用于實驗室快速診斷。