H9N2亞型禽流感嵌合病毒樣顆粒的制備

孫藝學，叢彥龍，李佳新，劉立軍

(1.長春大學 吉林省生物醫學工程研發中心，吉林 長春 130022；2.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062；吉林農業科技學院 動物科技學院，吉林 吉林市 132109)

禽流感是由A型流感病毒感染引起的家禽和野生禽類的高度接觸性傳染病。作為我國的一種地方流行性傳染病，H9N2亞型禽流感自20世紀90年代開始在我國禽群中流行至今。雖然其致死率不高，但常導致家禽呼吸道癥狀、產蛋率和肉料比下降，且容易引起并發或繼發感染，給養禽業造成嚴重的經濟損失[1-4]。疫苗免疫是預防禽流感最經濟有效的手段，對提高禽病防制水平，保障養禽業的健康發展具有十分積極的意義。目前國內預防H9N2禽流感的商品化疫苗均為滅活苗[5]。滅活疫苗制備技術有其優點，但亦存在著很大的缺陷。由于禽流感病毒易變異，且雙重及多重亞型病毒之間容易發生遺傳物質的交換，使滅活疫苗難以應付新的突變型禽流感病毒的感染，致使其長期有效性受到了極大挑戰[6]。因此，研制一類能夠快速應對禽流感的變異且更安全有效的疫苗至關重要。

由于病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)疫苗的免疫效果及其安全性優于滅活疫苗，因而成為近年的研究熱點。VLP是由某種病毒的一個或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，無法自主復制，不存在基因重組或重配和毒力回復的可能，不僅安全性高，而且可以模擬病毒粒子的天然結構激活細胞免疫和體液免疫，誘導的免疫保護更為全面[7]。同時，利用桿狀病毒表達系統在昆蟲懸浮細胞中能夠大規模生產VLPs。由于桿狀病毒表達系統不依賴雞胚生產，能夠保證禽流感大流行時疫苗的充足供應，且具有成本低、對環境友好、生產周期短、安全性高等優勢，因此利用桿狀病毒表達系統生產的VLP疫苗具有較大的應用潛力。

為了應對近年來G57基因型H9N2亞型禽流感在我國禽群中的普遍流行，本研究在利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統構建了由G57基因型H9N2禽流感病毒的HA和M1蛋白組裝而成的VLPs的同時，還利用該系統包裝了相應的HA蛋白和小鼠白血病病毒gag蛋白的VLPs。通過Western blot、血凝試驗和透射電鏡形態學觀察等方法對純化后的VLPs進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒、細胞、抗體A/chicken/Jilin/DH109/2012、pFastBac1、pFastBac1-gag、感受態細胞DH5α和DH10Bac、昆蟲細胞Sf9、雞抗H9N2亞型禽流感病毒高免血清和鼠抗小鼠白血病病毒gag蛋白陽性血清均為實驗室保存。

1.2 主要試劑LA Taq DNA Polymerase、BacPAK桿狀病毒快速滴定試劑盒購自TaKaRa公司； BamHⅠ和Hind Ⅲ購自NEB公司；Trans2K plus DNA Marker、T4DNA連接酶、X-gal、BCA蛋白測定試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、EasyPure?HiPure Plasmid提取試劑盒、病毒RNA/DNA基因組提取試劑盒購自康寧公司；Lipo3000 Transfection Reagent為Invitrogen公司產品；昆蟲無血清培養基Sf-900TMⅡ為Gibco公司產品；胎牛血清購自BI公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購于上海雅酶生物有限公司；羊抗小鼠IgG/HRP、兔抗雞IgG/HRP購于北京博奧森生物技術有限公司；蛋白Marker購于Thermo公司。

1.3 重組穿梭質粒的構建根據NCBI網站中H9N2亞型禽流感毒株A/chicken/Jilin/DH109/2012的HA(GenBank登錄號：KF886409)和M1(GenBank登錄號：KF886412)的基因序列，分別設計1對特異性擴增引物(表1)。提取病毒的RNA并對目的基因片段進行擴增。利用T4DNA連接酶將HA和M1等基因片段分別與pFastBac1載體于25℃連接30 min后轉化至DH5α感受態細胞中。用含有100 mg/L氨芐青霉素和100 mg/L慶大霉素的選擇培養基篩選陽性菌落。利用質粒小提試劑盒提取重組穿梭質粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。

表1 引物序列及相關信息

1.4 重組桿粒的構建將測序正確的3種重組穿梭質粒pFastBac1-HA、pFastBac1-M1和pFastBac1-gag分別轉化至DH10Bac感受態細胞中，加入無抗性LB后，置于30℃振蕩培養3 h進行同源重組。取適量菌液涂布于含有100 mg/L卡那霉素、50 mg/L慶大霉素、70 mg/L四環素、24 g/L IPTG和20 g/L X-gal的三抗固體篩選培養基上，于37℃避光培養24 h后挑取白色單菌落，分別使用特異性引物和M13通用引物進行重組桿粒的菌落PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌落接種于三抗液體LB培養基，于30℃振蕩培養3 h，然后在三抗固體篩選培養基上進行第2次劃線篩選，置于37℃培養箱中避光培養24 h，連續進行3次篩選以獲得陽性桿粒。

1.5 重組桿狀病毒的構建利用脂質體介導轉染法，參照Invitrogen公司的Lipo3000說明書，將重組桿粒rBacmid-HA、rBacmid-M1和rBacmid-gag分別轉染至Sf9昆蟲細胞。按照病毒基因組提取試劑盒說明書，分別提取P4代重組桿狀病毒的基因組，利用表1中的特異性引物及M13通用引物進行重組桿狀病毒的PCR鑒定，同時進行Western blot鑒定和血凝活性測定。將收取的P4代重組桿狀病毒rBV-HA、rBV-M1和rBV-gag利用BacPAK桿狀病毒快速滴定試劑盒進行滴度測定。

1.6 VLPs組裝與鑒定將rBV-HA和rBV-M1或rBV-gag以MOI=5共感染細胞密度為2.5×106個/mL的Sf9懸浮細胞，27℃培養96 h后收取細胞懸液，利用蔗糖密度梯度離心進行VLPs純化，將獲得的2種VLPs分別命名為VLP-M1和VLP-gag。通過透射電子顯微鏡觀察、血凝試驗和Western blot對兩者進行鑒定。

2 結果

2.1 重組穿梭質粒的鑒定以G57基因型H9N2亞型禽流感病毒A/chicken/Jilin/DH109/2012的cDNA為模板，利用表1中的引物擴增其HA和M1基因。將2個基因分別與pFastBac1載體連接構建重組穿梭質粒，通過酶切鑒定以檢測目的基因是否正確重組至pFastBac1載體中。如圖1所示，所構建的重組穿梭質粒pFastBac1-HA、pFastBac1-gag和pFastBac1-M1的目的基因的酶切產物均與預期大小相符，其中HA、gag和M1基因大小分別為1 701,1 561和759 bp。

2.2 重組桿粒的鑒定將重組穿梭質粒pFastBac1-HA、pFastBac1-gag和pFastBac1-M1經同源重組后，經過連續3次抗性篩選獲取陽性菌液，提取重組桿粒進行PCR鑒定。如圖2A的1%瓊脂糖凝膠電泳分析所示，利用基因特異性引物進行的PCR擴增結果均與預期大小相符。用M13引物擴增目的基因的鑒定結果如圖2B所示，其中含有HA基因片段的擴增產物大小約為4 050 bp，gag片段大小約為3 788 bp，M1片段大小約為3 116 bp，均與預期大小相符。將鑒定正確的陽性重組桿粒分別命名為rBacmid-HA、rBacmid-gag和rBacmid-M1。

A.特異性引物PCR鑒定結果;B.M13通用引物PCR鑒定結果;M.Trans2K plus DNA Marker；1.rBacmid-HA；2.rBacmid-gag；3.rBacmid-M1圖2 重組桿粒的PCR鑒定電泳結果

2.3 重組桿狀病毒的鑒定

2.3.1重組桿狀病毒感染Sf9細胞的病變觀察 將重組桿粒rBacmid-HA、rBacmid-gag和rBacmid-M1分別轉染Sf9細胞，盲傳后在倒置顯微鏡下可見到Sf9細胞體積變大、內部呈顆粒化、細胞核破裂等細胞病變效應(圖3)。將3種重組桿狀病毒分別命名為rBV-HA、rBV-gag和rBV-M1。

A.正常Sf9細胞；B.rBV-HA感染組；C.rBV-gag感染組；D.rBV-M1感染組圖3 重組桿狀病毒的致細胞病變效應

2.3.2重組桿狀病毒的基因組鑒定 分別收取盲傳后的P4代重組桿狀病毒液200 μL，按照病毒基因組提取試劑盒的說明書，提取其基因組，分別利用特異性引物和M13通用引物進行PCR鑒定，如圖4的1%瓊脂糖凝膠電泳結果所示，擴增產物均與2.2中的目的基因條帶大小相符。

A.特異性引物PCR鑒定結果;B.M13通用引物PCR鑒定結果;M.Trans2K plus DNA Marker；1.rBV-HA；2.rBV-gag；3.rBV-M1圖4 重組桿狀病毒基因組的PCR鑒定電泳結果

2.3.3重組桿狀病毒感染Sf9細胞后的目的蛋白表達鑒定 收集重組桿狀病毒感染后的Sf9細胞的上清液，與蛋白上樣緩沖液5∶1混勻，煮沸離心后制備成樣品進行Western blot鑒定。結果如圖5所示，在PVDF膜上的HA、gag和M1條帶大小分別約為63,55，27 kDa，目的相對蛋白分子質量均與預期大小相符。

M.蛋白質分子量標準；1.rBV-HA；2.rBV-M1；3.rBV-gag圖5 重組桿狀病毒表達目的蛋白的Western blot鑒定

2.3.4重組桿狀病毒的血凝活性測定 收集P4代重組桿狀病毒感染的Sf9細胞的上清液，離心后取上清進行血凝試驗。結果如圖6所示，P4代rBV-HA的血凝滴度可達24。

圖6 rBV-HA感染Sf9細胞血凝活性測定結果

2.3.5重組桿狀病毒滴度測定 采用BacPAK桿狀病毒快速滴定試劑盒對P4代重組桿狀病毒進行滴度測定。結果顯示，rBV-HA、rBV-gag和rBV-M1的病毒滴度分別為3.47×107,3.35×107和3.21×107PFU/mL。

2.4 VLPs的鑒定

2.4.1VLPs的形態觀察 分別將P4代重組桿狀病毒rBV-HA和rBV-gag，以及rBV-HA和rBV-M1同時感染Sf9懸浮細胞，96 h后將感染細胞置于28℃、120 r/min搖床培養。在此過程中，結構蛋白在宿主細胞中分別表達后會自行組裝，組裝后的VLPs會分泌到細胞培養上清中。取少量經蔗糖密度梯度離心純化后的VLP-gag和VLP-M1進行透射電子顯微鏡觀察，在VLP-gag的視野中可見直徑約150 nm、有囊膜且空心化的VLPs(圖7A)，而VLP-M1的粒子直徑約為100 nm(圖7B)，與天然流感病毒粒子的大小相符。此外，2種VLPs表面均具有明顯的纖突樣蛋白結構。

2.4.2VLPs的血凝活性檢測 由于禽流感病毒的HA蛋白具有凝集紅細胞的特性，本研究中的VLPs如果構建成功也會展示HA蛋白，因此也應具有血凝活性。據此，取純化后的VLPs各50 μL進行血凝活性檢測。如圖8,9所示，VLP-gag和VLP-M1的血凝滴度分別為28和27。

A.VLP-gag;B.VLP-M1圖7 透射電鏡下VLPs的形態觀察

圖8 VLP-gag的血凝活性檢測結果

圖9 VLP-M1的血凝活性檢測結果

2.4.3VLPs的Western blot鑒定 為了進一步鑒定所制備的VLP-gag和VLP-M1是否在昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統組裝成功，通過Western blot對它們的目的蛋白組分進行鑒定。如圖10所示，用雞抗H9N2亞型禽流感病毒高免血清和鼠抗小鼠白血病病毒gag蛋白陽性血清，Western blot同時檢測到了與預期大小相符的HA和M1或gag蛋白條帶，證明VLP-gag和VLP-M1均由相應的目的蛋白組裝而成。

M.蛋白質分子量標準；1.VLP-M1；2.VLP-gag圖10 VLPs蛋白組分鑒定

3 討論

流行病學調查研究顯示，從2010年起，G57基因型已經發展成為我國H9N2亞型禽流感病毒的優勢基因型[8]。免疫是預防禽流感的有效防控手段。由于VLPs的安全性和免疫原性優于滅活苗，因此成為新型疫苗的研制熱點。當前利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統構建VLPs的技術已經非常成熟，但是其生產成本要比滅活疫苗等傳統疫苗高許多。對于獸用疫苗，疫苗的生產成本是本研究重點考慮的因素。

病毒粒子的形狀和大小主要取決于基質或衣殼蛋白的直徑。由于小鼠白血病病毒粒子的平均直徑為150～180 nm，明顯大于流感病毒的粒子直徑(80～120 nm)[9]，預示著如果利用gag作為流感病毒VLPs的骨架蛋白，產生的VLPs將具有更大的表面積，由此有望容納更多的流感病毒的主要保護性抗原蛋白，即病毒表面的纖突蛋白—HA和NA。由gag和HA和/或NA組裝產生的VLPs，可以使HA和/或NA盡可能多地嵌入到gag蛋白上，由此提高免疫原的含量，進而產生更好的免疫效果。據此，本研究將H9N2亞型禽流感病毒的最主要保護性抗原—HA蛋白和該病毒的基質蛋白M1或小鼠白血病病毒的gag蛋白在昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統中進行了自我組裝，構建了基質蛋白不同來源的兩種VLPs，分別命名為VLP-M1和VLP-gag。利用蔗糖密度梯度離心對純化后的VLPs進行透射電鏡觀察，在視野中可見兩種VLPs的形態結構與野生型H9N2亞型禽流感病毒非常相似，其中裝配有gag蛋白的VLPs的直徑大小約為150 nm，明顯大于VLP-M1的粒子大小(約100 nm)。血凝試驗結果顯示，所構建的VLP-gag比VLP-M1提高了一個血凝滴度，表明VLP-gag顆粒表面鑲嵌的HA蛋白數量多于VLP-M1。Western blot鑒定結果進一步證實，在VLP-M1和VLP-gag中均可以同時檢測到HA和M1或gag，表明目的蛋白在昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統中進行了成功組裝。上述鑒定結果表明，VLP-gag和VLP-M1構建正確，VLP-gag的表面積大于VLP-M1，前者的血凝活性高于后者，由此實現了本研究的預期設計目標。

總之，本研究昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統同時構建了基質蛋白不同來源的、可以展示G57基因型H9N2亞型禽流感病毒主要免疫原—HA蛋白的兩種VLPs，為下一步比較VLP-gag和VLP-M1的免疫原性和免疫保護效果奠定了基礎。此外，由于VLP-gag免疫后僅能刺激機體產生特異性的H9N2亞型禽流感病毒的HA抗體和小鼠白血病病毒的gag抗體，而不會產生針對H9N2亞型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS等抗體，所以可以利用它作為標記疫苗用于區分臨床上H9N2亞型禽流感病毒的野毒感染和滅活疫苗免疫，從而有望為H9N2亞型禽流感的凈化提供技術支持。