3種豬自然細胞毒性受體多克隆抗體制備與鑒定

杜 謙，楊 楠，史騰飛，朱 磊，黃 勇，童德文

(西北農林科技大學 動物醫學學院，陜西 楊凌 712100)

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是機體先天免疫的重要組成部分，與機體的抗病毒感染和免疫調節密切相關[1]。在機體抵抗病毒感染過程中，NK細胞主要通過自然殺傷作用直接靶向殺傷被感染的細胞，進而控制病毒的感染。在機體產生了針對病毒抗原的特異性抗體后，NK細胞可以通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)來殺傷被感染的靶細胞，從而進一步達到清除病毒的目的[2]。另外，NK細胞還具有間接的免疫調節功能，它可以與機體其他多種免疫細胞相互作用，調控這些免疫細胞的數量和功能，從而調節機體的免疫功能，增強機體免疫系統對病毒反應能力[3]。NK細胞的這些功能受其細胞膜上相應受體產生的抑制和激活信號控制[4]。自然細胞毒性受體(natural cytotoxicity receptors，NCRs)是一類NK細胞的重要受體[5]，主要由3種Ⅰ型跨膜蛋白NCR1(NKp46)、NCR2(NKp44)和NCR3(NKp30)組成，分別由基因NCR1、NCR2和NCR3編碼[6]。NK細胞上這些受體的選擇性參與可以刺激NK細胞產生細胞毒性，當NCRs與靶細胞上的相應配體(NCR ligands，NCRLs)結合，NK細胞被激活后，通過定向分泌穿孔蛋白和顆粒酶至靶細胞，同時通過分泌包括γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在內的細胞因子，啟動靶細胞的凋亡程序，進而殺傷靶細胞[7]。NCRs以跨膜蛋白的形式貫穿NK細胞的細胞膜，其結構域可分為跨膜域、胞內域和胞外域3部分，其中胞外域一般指膜蛋白位于細胞外的區段，具有識別配體分子并激活信號通路的作用，因而多以NCRs胞外域作為抗原制備抗體，進而研究這些受體在病毒防御中的作用[8]。

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)和非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)等多種病原感染后均可引起豬淋巴細胞數量減少[9-11]，而這種淋巴細胞數量減少可能與NK細胞的異常激活有關[12]。因此，研究PCV2、PRRSV和ASFV等病毒感染后豬NK細胞的自然細胞毒性受體(porine NCRs，pNCRs)的功能對于闡述這些病毒的致病機制至關重要。但是，目前尚無制備pNCRs抗體的相關報道，制約了進一步深入研究pNCRs的功能及其在病毒致病過程中作用及機制。本研究擬通過在線軟件預測和分析pNCRs的胞外域編碼序列，原核表達重組pNCRs胞外域(outside cellular regions of pNCRs，opNCRs)目的蛋白，將重組蛋白免疫新西蘭白兔后制備具有高效價和良好特異性的兔抗pNCRs多克隆抗體，為進一步研究pNCRs在病毒致病過程中的作用及機制提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和試驗動物大腸桿菌Rosetta感受態細胞、大腸桿菌DH5α感受態細胞、pET-32a質粒均由西北農林科技大學動物病理學實驗室保存。8周齡雌性新西蘭白兔購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑瓊脂糖凝膠核酸回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自美國Omega公司，蛋白Marker購自碧云天生物技術有限公司，2×Taq PCR PreMix購自日本TaKaRa公司，NheⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ等限制性核酸內切酶以及T4DNA Ligase、DL2000 DNA Marker等均購自大連寶生物工程有限公司，鎳離子螯合磁珠購自海貍生物科技有限公司，HRP標記羊抗兔IgG購自西安晶彩生物技術有限公司，FITC標記的羊抗兔IgG購自Proteintech，抗豬CD3單克隆抗體和抗豬CD8單克隆抗體購自BD Bioscience。

1.3 3種豬pNCRs胞外域預測和分析在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索豬pNCR1、pNCR2和pNCR3的基因編碼序列及相應的氨基酸編碼序列，將檢索到的序列通過在線軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)預測豬pNCR1、pNCR2和pNCR3胞外域的氨基酸序列，及其相應的基因編碼序列，最后將在線軟件預測結果和已知的人NCRs胞外域信息比對，確定豬pNCR1、pNCR2和pNCR3的胞外域編碼序列。

1.4 引物設計與合成根據上述預測和分析獲得的pNCR1、pNCR2及pNCR3胞外域基因編碼序列，使用Primer Premier 5.0設計pNCR1、pNCR2及pNCR3胞外域基因特異性引物，并根據目的載體pET-32a設計相應的酶切位點。引物序列見表1。

表1 pNCR1、pNCR2及pNCR3胞外域基因編碼序列引物

1.5 目的基因opNCR1、opNCR2及opNCR3擴增以豬cDNA為模板，PCR擴增目的基因opNCR1、opNCR2及opNCR3。反應體系為：Primer-F(10 μmol /L)1.0 μL、Primer-R(10 μmol/L)1.0 μL、模板1.0 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環；72℃延伸10 min。

1.6 重組表達載體pET-opNCR1、pET-opNCR2、pET-opNCR3構建用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR回收產物opNCR1、opNCR2、opNCR3及pET-32a空質粒，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物。將經雙酶切的opNCR1、opNCR2和opNCR3分別與經雙酶切的pET-32a質粒用T4連接酶于16℃水浴條件中過夜連接16 h左右，接著將連接產物加入50 μL DH5α感受態細胞中，冰上孵育30 min，42℃熱激90 s，然后冰上孵育2～3 min后，加入1 mL無抗性LB培養液，接著37℃、220 r/min搖床中孵育45 min，室溫離心后涂板。培養12～14 h后挑取單克隆擴大培養。經過PCR和雙酶切鑒定后，陽性克隆送往上海生工生物公司測序。

1.7 重組蛋白opNCR1、opNCR2及opNCR3誘導表達將經鑒定構建成功的重組質粒pET-opNCR1、pET-opNCR2、pET-opNCR3以及空載pET-32a的保存菌液活化后，分別將其按照1∶100的比例接種于8 mL含0.1% Amp的LB培養液中進行培養。當菌液D600 nm=0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在轉速為180 r/min的搖床上28℃誘導表達5 h，離心收集菌體，用1 mL PBS將菌體重懸，將菌液經超聲裂解15 min后離心并重懸，分別取超聲后上清和沉淀重懸液各80 μL，加入20 μL含β巰基乙醇的蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。

1.8 opNCRs蛋白表達純化和濃縮按照1.7中的方法誘導重組opNCRs蛋白表達，使用鎳離子螯合磁珠進行重組opNCRs蛋白的純化。按照說明書進行純化，收集洗脫液體。接著將洗脫液透析并用超濾管濃縮，-20℃保存。

1.9 動物免疫試驗將8周齡雌性新西蘭白兔隨機分為4組，每組4只，試驗動物分組為：第1組為opNCR1組，第2組為opNCR2組，第3組為opNCR3組，第4組為空白對照組。以純化后的opNCR1、opNCR2和opNCR3重組蛋白作為免疫原，并按照表2進行背部皮下多點注射。第2次加強免疫14 d 后，收集血清并檢測血清相應效價及抗體特異性。

表2 動物免疫程序

1.10 抗體血清效價檢測將純化的opNCR1、opNCR2和opNCR1蛋白用ELISA包被液稀釋成5 mg/L，加入ELISA專用96孔板，4℃包被過夜，PBST洗3次；加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗3次；將采集的兔血清1∶100稀釋后，進行2倍倍比稀釋，分別加入96孔板各孔中，孵育1 h，PBST洗3次；各孔加入HRP標記羊抗兔IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBST洗3次；最后加入TMB顯色液，充分顯色后加入終止液，酶標儀讀取D450 nm值，當檢測孔與陰性孔的比值≥2.1時的最大稀釋倍數為該血清的抗體滴度。

1.11 Western blot采集健康豬外周血，利用淋巴細胞分離液分離豬外周血單個核細胞，然后利用磁珠分選分離豬NK細胞。將分離的豬NK細胞裂解，提取總蛋白作為目的蛋白樣，制備SDS-PAGE凝膠，加樣后電泳直到樣品電泳至膠底。電泳結束后，用經甲醇活化過的PVDF膜進行轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，將獲得的兔抗opNCRs多克隆抗體分別以其最高稀釋倍數進行稀釋后孵育PVDF膜，4℃過夜后，PBST清洗3次。HRP標記羊抗兔IgG室溫震蕩孵育2 h，PBST清洗3次，使用化學發光劑在暗室中進行顯影。

1.12 流式細胞術采集健康豬外周血，分離豬外周血單個核細胞，將其稀釋為106個細胞/支，以100 μL PBS重懸，分別加入抗豬CD3單克隆抗體、抗豬CD8單克隆抗體以及制備的兔抗opNCRs多克隆抗體，室溫孵育30 min，PBS清洗2次，分別加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30 min，PBS清洗2次，離心后以100 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 3種豬pNCRs胞外域預測結果在NCBI檢索確定pNCR1、pNCR2和pNCR3的mRNA編碼序列分別為NM_001123143.1、XM_021098670.1和EU282355.1。使用在線軟件TMHMM預測pNCR1、pNCR2和pNCR3的胞外域，結果顯示：pNCR1的胞外域為1～255 aa，pNCR2的胞外域為1～347 aa，pNCR3的胞外域為1～95 aa(圖1)。將在線軟件預測結果與人NCRs的胞外域信息比對后，確定pNCR1的胞外域為1～255 aa、pNCR2的胞外域為1～192 aa、pNCR3的胞外域為1～95 aa。

transmembrane.跨膜域；inside.胞內域；outside.胞外域圖1 pNCR1、 pNCR2、pNCR3胞外域分析結果

2.2 重組表達載體pET-opNCR1、pET-opNCR2、pET-opNCR3構建與鑒定結果PCR擴增目的基因pNCR1、pNCR2和pNCR3胞外域序列后，分別連接至pET-32a質粒上，涂板挑取陽性克隆菌落擴大培養后提取質粒，利用雙酶切和測序鑒定重組質粒構建情況。結果如圖4，5所示，PCR擴增獲得了pNCR1、pNCR2和pNCR3胞外域編碼基因，分別在約765，576和285 bp處出現特異性條帶，與預期片段大小一致(圖4)；將重組質粒進行雙酶切鑒定，分別在約5 000，765，576和285 bp處出現特異性條帶，與預期片段大小一致(圖5)；最后經測序，結果與NCBI上公布的豬pNCR1、pNCR2和pNCR3序列一致，表明重組表達載體pET-opNCR1、pET-opNCR2、pET-opNCR3構建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.opNCR1的PCR結果；3，4.opNCR2的PCR結果；5，6.opNCR3的PCR結果圖4 opNCR1、opNCR2和opNCR1基因擴增產物

M.1 kb plus DNA Marker；1，2.pET-opNCR1的酶切鑒定；3，4.pET-opNCR2的酶切鑒定；5，6.pET-opNCR3的酶切鑒定圖5 重組載體雙酶切鑒定結果

2.3 重組蛋白opNCR1、opNCR2及opNCR3誘導表達及純化結果將構建的pET-opNCR1、pET-opNCR2、pET-opNCR3重組表達載體在大腸桿菌Rosetta表達系統中誘導表達，并將表達產物經由磁珠純化，SDS-PAGE鑒定目的蛋白opNCR1、opNCR2和opNCR3表達及純化結果。結果如圖6～8所示，目的蛋白opNCR1、opNCR2和opNCR3均被成功誘導表達，其中opNCR1主要存在于包涵體中，而opNCR2和opNCR3在表達上清和包涵體中均存在；將opNCR1、opNCR2和opNCR3經由磁珠純化后分別獲得了大小為約48,41和30 kDa的純化目的蛋白。計算opNCR1、opNCR2和opNCR3蛋白的得率分別為38.3%,11.2%和12.8%。

M.DNA Marker；1.pET-32a空載誘導；2.pET-opNCR1蛋白誘導后全菌；3.pET-opNCR1蛋白誘導后上清；4.pET-opNCR1包涵體；5.純化的opNCR1蛋白。下同圖6 重組載體蛋白表達鑒定結果

圖7 重組載體蛋白表達鑒定結果

圖8 重組載體蛋白表達鑒定結果

2.4 抗體效價檢測結果將純化的重組opNCR1、opNCR2和opNCR3目的蛋白分別免疫新西蘭白兔后，收集血清，間接ELISA檢測獲得的opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體效價。結果如圖9所示，獲得的兔抗opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體的效價分別達到1∶25 600,1∶12 800和1∶25 600，表明獲得的兔抗opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體均具有較高的效價。

P/N值為檢測孔與陰性孔的比值，當P/N≥2.1時的最大稀釋倍數即為該多克隆抗體效價圖9 抗體效價檢測結果

2.5 Western blot檢測結果將分離的豬NK細胞裂解并提取總蛋白后作為目的蛋白樣，分別以1∶25 600,1∶12 800,1∶25 600稀釋后的兔抗opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體作為一抗，Western blot檢測目的蛋白的表達并將試驗結果進行灰度分析。結果顯示，在NK細胞裂解蛋白中分別檢測到了大小約為48，41和30 kDa的pNCR1、pNCR2和pNCR3特異性條帶，而采用陰性血清對照(NC)均未檢測到相應蛋白表達，灰度分析檢測結果差異均極顯著(圖10)。

2.4.3流式細胞術檢測結果 分離健康豬外周血單個核細胞，分別加入抗豬CD3單克隆抗體、抗豬CD8單克隆抗體、制備的兔抗opNCRs多克隆抗體及FITC標記的二抗，室溫孵育后流式細胞儀檢測。結果顯示，流式細胞術均能檢測到NK細胞表面pNCR1、pNCR2和pNCR3的表達，其中pNCR1和pNCR3陽性的NK細胞所占比例分別能達到60.2% 和59.5%，而pNCR2陽性的NK細胞所占比例僅為0.65%，但應用所制備的兔抗pNCR1、pNCR2和pNCR3多克隆抗體檢測到NK細胞表面的pNCR1、pNCR2和pNCR3表達水平均顯著高于陰性血清(圖11)。

A.流式細胞術檢測結果；B.pNCRs陽性率統計結果；*和**.分別代表抗opNCRs多克隆抗體相比陰性血清(NC)結果差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)圖11 流式細胞術檢測檢測NK細胞pNCRs表達結果

A.pNCR1檢測結果及灰度分析結果；B.pNCR2檢測結果及灰度分析結果；C.pNCR3檢測結果及灰度分析結果；**.代表抗opNCRs多克隆抗體相比陰性血清(NC)結果極顯著(P<0.01)圖10 Western blot檢測NK細胞pNCRs表達結果

3 討論

NCRs是NK細胞表面特有的標志物[13]，在NK細胞調控淋巴細胞數量過程中發揮著重要的作用。獲得性淋巴細胞減少癥是通常由細菌或病毒等病原感染導致的一種伴有外周血淋巴細胞數量減少的綜合征，使機體更易于被其它病原感染[14]。HIV是最常見的導致淋巴細胞減少癥的病原，研究發現HIV感染機體后能上調NK細胞NCR2的表達，同時誘導CD4+T細胞高表達NCR2L，激活NK細胞進而殺傷CD4+T淋巴細胞，導致淋巴細胞減少[12]。同時，研究發現PCV2感染仔豬后，仔豬淋巴細胞數量減少[9]；PRRSV可導致T細胞耗竭[10]；ASFV感染早期淋巴細胞和單核細胞數量減少[11]。這些病原感染導致的淋巴細胞減少可能與被感染豬體內NK細胞的異常激活有關，但目前尚無制備pNCRs抗體的相關報道。因此，本研究通過pET-32a原核表達系統獲得了opNCR1、opNCR2和opNCR3可溶性重組目的蛋白，免疫新西蘭白兔后獲得了兔抗opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體，可用于Western blot和流式細胞術檢測NK細胞pNCR1、pNCR2和pNCR3的表達。

NCRs可分為3個結構域：跨膜域、胞內域和胞外域。NCRs的胞外域即位于細胞外部的區段，是識別配體并傳導信號的主要功能域，在NK細胞的活化過程中起著至關重要的作用[8]。NCR1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，其細胞外部分有2個C2型Ig樣區域，類似于白細胞免疫球蛋白樣受體和殺傷抑制受體[15]；NCR2是Ig超家族的成員，其特征是一個胞外的V型Ig樣區域和一個細胞質尾部包含一個基于酪氨酸的免疫受體抑制基序[16]；NCR3也是Ig超家族的成員，包含一個負責于配體結合的細胞外免疫球蛋白域，一個帶正電荷的精氨酸殘基的跨膜結構域和沒有附加信號域的細胞內結構域[17]。目前的研究證實，人NK細胞可表達NCR1、NCR2和NCR3，而小鼠NK細胞僅表達NCR1，不存在NCR2和NCR3的同源基因[18]。因此本研究前期將檢索到的pNCR1、pNCR2和pNCR3基因編碼序列與人的同源序列進行了比對，pNCR1基因與人NCR1基因編碼序列同源性為72%，pNCR2基因與人NCR2基因編碼序列同源性為70.3%，pNCR3基因與人NCR3基因編碼序列同源性為80%，pNCRs與人NCRs之間較高的同源性可能有助于預測和分析pNCRs的結構。隨后，本研究通過在線軟件預測了豬pNCR1、pNCR2和pNCR3的胞外域，結果顯示pNCR1的胞外域為1～255 aa，pNCR3的胞外域為1～95 aa，而pNCR2的胞外域為其全長為1～347 aa，這顯然與該蛋白的實際結構不符。因此，本研究參考人NCR2的胞外域信息，分析并確定了pNCR2的胞外域應為1～198 aa。

有研究表明，在人體內，NCR1和NCR3在靜息和激活的NK細胞上均有表達，而NCR2只有在NK細胞被激活后才被誘導表達[19]。但是，NCR1、NCR2和NCR3均被證明能介導NK細胞對病毒感染靶細胞的識別和激活NK細胞，從而殺死靶細胞。例如，新城疫病毒感染的靶細胞上NCR1和NCR2的配體表達上調，激活NK細胞，從而殺傷靶細胞[20]。登革熱病毒和西尼羅河病毒感染的細胞中，病毒囊膜蛋白轉位至靶細胞表面，被NK細胞的NCR2識別，激活NK細胞并殺傷靶細胞[21]。本研究利用制備的兔抗opNCRs多克隆抗體檢測健康豬NK細胞表面NCRs表達時發現，在健康豬的NK細胞表面pNCR2表達豐度特別低，這和上述文獻報道中，NCR2只在被激活的NK細胞上表達的結果一致[19]。表明在豬NK細胞中，NCRs的表達與人的同源蛋白具有高度的相似性。綜合上述結果，本研究成功獲得豬opNCR1、opNCR2和opNCR3多克隆抗體，將為進一步研究豬的pNCR1、pNCR2和pNCR3生物學功能以及揭示豬的一些重要病毒致病機制奠定基礎。