胸膜肺炎放線桿菌 Apx Ⅳ 與多殺性巴氏桿菌 OmpH 基因的表位篩選及真核表達載體的構(gòu)建

姚景麗，武靜橋，范真瑋，張東超，趙 微，陳 婷，何敬文，金天明

(天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocide，Pm) 引起的豬萎縮性鼻炎(porcine infectious atrophic rhinitic，AR)以及豬肺疫(swine pneumonic pasteurellosis)是豬場常見的呼吸道傳染病，常呈混合感染,因此，二聯(lián)疫苗的研發(fā)具有現(xiàn)實必要性。

溶血外毒素(Apx)是 APP 引起宿主肺部感染最主要的毒力因子。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 Apx 有 ApxⅠ/ApxⅡ/ Apx Ⅲ/ Apx Ⅳ 4種，研究發(fā)現(xiàn)，Apx Ⅳ 存在于 APP 所有血清型中，可使血清抗體效價較其他外毒素明顯增加，功毒試驗可提供完全保護[1]。豬巴氏桿菌 OmpH 作為菌體外膜蛋白的一種，可有效誘導動物產(chǎn)生特異抗體，從而發(fā)揮免疫保護作用。抗原表位又稱抗原決定簇，是抗原分子中決定其特異性的化學基團。抗原表位與相應的淋巴細胞表面抗原受體相結(jié)合，進而激活淋巴細胞，引起免疫應答反應[2]。在免疫應答過程中，被 T 細胞受體(TCR)識別的表位稱作T細胞表位，被 B 細胞受體(BCR)識別的表位稱作 B 細胞表位[3]。表位疫苗是基于已知結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸或氨基酸序列，利用計算機軟件進行輔助分析，篩選抗原蛋白上 T、B 細胞所識別的優(yōu)勢抗原表位，經(jīng)人工合成或借助基因工程技術(shù)制備含有優(yōu)勢抗原表位的多肽疫苗。抗原表位間插入柔性肽進行連接，所構(gòu)建的新肽段，可以避免抗原表位間形成新的表位[4]，有利于抗原結(jié)合。多表位疫苗技術(shù)現(xiàn)已成為當前疫苗研究領域的一種新型策略[5]。

本研究通過多種在線軟件分析 Apx Ⅳ與 OmpH 基因序列的 B 細胞、T 細胞優(yōu)勢抗原表位，構(gòu)建出新肽段 New，并對其進行抗原性分析。而后將 Apx Ⅳ、 OmpH 和 New 肽段構(gòu)建至真核表達載體，并對所構(gòu)建的載體進行分析評估。抽提所構(gòu)建 3 種真核質(zhì)粒按照一定比例混合，可制備傳染性胸膜肺炎與多殺性巴氏桿菌二聯(lián)疫苗，由于該疫苗中加入 New 表位序列，可發(fā)揮協(xié)同免疫作用。

1 材料與方法

1.1 基因的來源與序列合成OmpH 基因序列(GenBank:U52208.1)、ApxⅣA(559-1288aa)基因序列(GenBank:AF021919.1)、New表位序列由在線軟件篩選構(gòu)建，GV658 載體購自上海吉凱基因科技有限公司，以上序列均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ/ EcoRⅠ 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Bingds FLAG tag sequence antibody 購自 Abcam 公司；Goat anti-Rabbit IgG(HRP conjugate ) 購自成都正能生物技術(shù)有限責任公司；AlxaFlour 647 標記山羊抗兔 IgG(H+L) 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞總 RNA 提取試劑盒購自 TIANGEN 公司；TaKaRa OneStep RNA PCR kit(AMV) 購自 TaKaRa 公司；CCK8 Kit 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 抗原表位的篩選及連接B 細胞表位篩選，通過在線軟件ABCPred[6]和IEBD[7]，分別預測 Apx Ⅳ、OmpH B細胞表位，選擇 2 個軟件重疊且評分較高肽段作為目的表位。

T細胞表位篩選，通過 CTL 表位篩選軟件 NetCTLpan[8]、IEDB(MHC Ⅰ binding)[9-10]和 THL 表位篩選軟件 IEDB(MHC Ⅱ binding) 分別預測 Apx Ⅳ、OmpH 基因的表位，選擇每種軟件不同等位基因重疊的肽段，從中選出評分較高的肽段作為目標表位，然后將以上所選肽段通過 VaxiJen軟件預測其免疫原性[11]，同時用 ToxinPred軟件預測是否具有細胞毒性[12]， 最后選取評分高、免疫原性好且無細胞毒性肽段作為目標表位。

將上述篩選出來的 B 細胞和 T 細胞表位通過柔性肽 GPGPG 連接構(gòu)建出新的肽段 New。

1.4 New 肽段免疫源性分析通過 DNAstar、SOPMA、ExPASY、VaxiJen、ALGPRDE 在線軟件對 New 肽段進行二級結(jié)構(gòu)、親水性、柔性、抗原性和過敏性分析。

1.5 重組真核表達載體的構(gòu)建

1.5.1同源重組引物設計 根據(jù) OmpH 蛋白、Apx ⅣA、New 序列及線性化載體兩端序列設計引物，擴增引物包含交換配對堿基、酶切位點(下劃線標記)以及目的基因 5′端部分序列。引物由吉凱基因生 物科技有限公司合成。

1.5.2PCR 擴增目的基因及與載體進行連接 通過 PCR 反應進行目的基因擴增。依照表 2 中的反應體系，將上述 PCR 產(chǎn)物于冰浴中配制，用移液槍輕輕吹打混勻，瞬時離心，于 37℃反應 30 min，然后置于冰水中冷卻 5 min 后立即進行轉(zhuǎn)化，并進行載體連接。

表2 連接反應體系

1.5.3轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細胞 將以上成功構(gòu)建的質(zhì)粒 GV658-Apx Ⅳ、GV658-OmpH、GV658-New 分別轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌 TOP10 感受態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性培養(yǎng)基挑選陽性克隆。

1.5.4重組質(zhì)粒圖譜 如圖 1 所示，A/B/C/D 分別為質(zhì)粒 GV658-空載、GV658-Apx Ⅳ、 GV658-New、GV658-OmpH。

1.6 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆菌(加入卡那霉素)過夜培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒,利用限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 EcoRⅠ分別對質(zhì)粒 GV658-Apx Ⅳ、GV658-OmpH、GV658-New 進行雙酶切，驗證目的條帶大小。

1.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞將 HNK293 細胞依照 1×105個/孔加入 6 孔細胞培養(yǎng)板，于含 10%FBS 的 MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞融合度至 60%～70%，利用轉(zhuǎn)染試劑 GeneTwinTM基因轉(zhuǎn)染試劑對 GV658-Apx Ⅳ、 GV658-OmpH、GV658-New 質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，分別于 12,24,36,48 h 對轉(zhuǎn)染后每組細胞在熒光顯微鏡下進行拍照，觀察重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中的表達情況。

1.8 RT-PCR 驗證重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中的轉(zhuǎn)錄水平重組質(zhì)粒 GV658-Apx Ⅳ、GV658-OmpH、GV658-New 成功轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞培養(yǎng) 48 h 后，經(jīng) PBS 漂洗 2 次，按照試劑盒步驟提取總 RNA，然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得 cDNA。以 cDNA 為模板，用表 1 中的引物，進行 PCR 反應(程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 1 min，共 35 個循環(huán)；73℃ 15 min),將上述 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。

表1 引物信息

1.9 Western blot 驗證重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中蛋白的表達情況各組重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞培養(yǎng) 48 h 后，經(jīng) PBS 漂洗2次，加入細胞裂解液，使其充分裂解后，收集至 2 mL 離心管中，加入4×蛋白上樣緩沖液，于100℃煮沸 20 min， 使其充分變性，迅速冷卻后備用。將上述蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(Flag 標簽的兔 IgG 抗體)、孵育二 抗(辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠 IgG 抗體)漂洗后，避光加入顯色液，在 Bio-Rad 凝膠成像儀中，進行拍照并保存。

1.10 免疫熒光(IF)驗證重組質(zhì)粒蛋白在細胞中的免疫定位根據(jù)組別，于 24 孔培養(yǎng)板中加入多聚賴氨酸，孵育 1～2 h，棄去液體后于培養(yǎng)箱中過夜。調(diào)整細胞濃度為 2.0×104個/mL，進行鋪板，培養(yǎng) 24 h 后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h， 經(jīng) PBS 漂洗 2 次，加入 4%的多聚甲醛于 4℃固定；PBST 漂洗后加入 0.5%的 TritonX-100 進行細胞打孔；經(jīng) PBST 漂洗后加入 5%BSA 進行封閉；PBST 漂洗后加入一抗(Flag 標簽兔單克隆抗體)孵育；PBST 漂洗后加入二抗孵育(AlxaFlour 647 標記的山羊抗兔多克隆抗體)， PBST 漂洗后加入抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

A～D.分別為質(zhì)粒 GV658-空載、GV658-Apx Ⅳ、GV658-New、GV658-OmpH圖1 重組質(zhì)粒圖譜

1.11 CCK-8法評估重組質(zhì)粒對細胞的安全性取濃度為 1.0×104個/mL 的 HEK293A 細胞，于 96 孔板進行鋪板，待細胞覆蓋率達到 60%～70%，將 GV658-OmpH、GV658-Apx ⅣA、GV658-New、GV658-空載質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑組， 按照4個質(zhì)量濃度 25，50，100，200 μg/L 進行轉(zhuǎn)染，分別于 24，48，96 h，加入 CCK8 溶液 100 μL，于 37℃避光孵育 0.5～1.0 h，用酶標儀在 450 nm 波長檢測每孔的吸光值，計算細胞活力。

2 結(jié)果

2.1 抗原表位的篩選及連接對目的片段 Apx ⅣA 和 OmpH 進行 B 細胞、T 細胞表位預測，選取評分較高且 2～3 個軟件重疊的肽段并進行抗原性分析，篩選結(jié)果如表 3。將篩選出的序列通過連接肽 GPGPG 連接，同時在 N 末端添加 Flag 標簽，構(gòu)建出的新肽段命名為 New，其序列為：

表3 Apx IVA 和 OmpH 序列 B、T 細胞表位預測結(jié)果

DGDGLETVSMNGRQGAGPGPGLADLDTNQD-QRIDQNDGPGPGIVYEDTNNDNRARDI DGPGPGTDVNYAEVKFRRVDNDGPGPGAQSKVTN-VEGKKRALEGPGPGFVEGGWGREKDANGVT-GPGPGLNFSFNPFYGPGPGGLNIDQLYYGPGP-GRVDNDLMLFGPGPGLEAGYSQKYGPGPGR-ALEVGLNYGPGPGDSSASVVRVTPSQLSGPG-PGTRLKKYVYSVNAKQFGPGPGFTFGGAYV-FSADADK

2.2 New 序列二級結(jié)構(gòu)、抗原性和過敏性分析通過在線軟件 SOPMA 對 New 序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖 2 所示，α螺旋為 0.4%， β轉(zhuǎn)角為 3.59%，延伸連為 38.65%，無規(guī)則卷曲為 57.37%，表明該序列二級結(jié)構(gòu)中較少的 α螺旋、β轉(zhuǎn)角，結(jié)構(gòu)松散有利于與免疫源結(jié)合；用 VaxiJen 軟件預測 New 序列的抗原性， 評分為 1.334 5，分值大于 0.4 即為具有抗原性，該序列預測結(jié)果顯示其抗原性較好；用 ALGPRDE 軟件預測 New 序列的過敏性，結(jié)果顯示 New 序列無過敏性(圖 2)。

圖2 New 序列二級結(jié)構(gòu)分析

2.3 New 序列穩(wěn)定性分析通過在線軟件 ExPASY 對 New 序列進行分析，結(jié)果顯示，該序列不穩(wěn)定指數(shù)為 13.83%，脂肪指數(shù)為 53.19，脂肪指數(shù)高更具熱穩(wěn)定性；親水性結(jié)果如圖 3 所示，平均值(GRAVY)為-0.726。此結(jié)果表明 New 序列較穩(wěn)定，親水性較好。

圖3 New 序列親水性分析

2.4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定抽提 GV658-OmpH、GV658-Apx ⅣA 和 GV658-New 重組質(zhì)粒，經(jīng) BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 4 所示，分別獲得 960,2 190,756 bp 目的片段，與目的基因相符，經(jīng)測序和同源性分析，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失、增加及突變，表明 3 種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.1 kb DNA Marker;1.GV658-New;2.GV658-ApxⅣA;3.GV658-OmpH圖4 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.5 重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中的表達情況熒光顯微鏡下觀察，重組質(zhì)粒 GV658-OmpH、GV658-Apx ⅣA 和 GV658-New 轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞，在 12 h 開始表達，表現(xiàn)出綠色熒光,且熒光強度在 24，36，48 h 逐步增強。 結(jié)果表明，各重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中均可成功表達，48 h 表達效果最好(圖 5)。

圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 NHK293A 細胞結(jié)果

2.6 RT-PCR 驗證重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中的轉(zhuǎn)錄水平將 3 種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞 48 h 后，提取總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為 cDNA， 用表 1 中的引物進行 PCR，驗證重組質(zhì)粒在細胞中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖 6 所示，成功獲 得 960，2 190，765 bp 的特異性條帶，與預期完全一致，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293A 細胞后，目的基因在 HNK293 細胞中成功進行轉(zhuǎn)錄。

2.7 Western blot 驗證重組質(zhì)粒在 HNK293 細胞中的蛋白表達將 3 種重組和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞 48 h 后，用獲得的蛋白進行 Western blot， 結(jié)果如圖 7 所示，Apx ⅣA、OmpH、New 蛋白，分別在 83，38，30 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶，空載及未轉(zhuǎn)染的 NHK293 細胞未出現(xiàn)特異性條帶， GAPDH 內(nèi)參各組均在 36 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果表明，添加 Flag 標簽的 Apx ⅣA、OmpH 蛋白及New基因蛋白在 HNK293A 細胞中能夠成功表達，且特異性蛋白條帶與目的基因相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.分別為GV658-OmpH、GV658-Apx ⅣA 和 GV658-New圖6 重組質(zhì)粒 RT-PCR 結(jié)果

圖7 重組質(zhì)粒在 NHK293A 細胞中的蛋白表達情況

2.8 免疫熒光(IF)驗證重組質(zhì)粒 在HNK293 細胞中的免疫定位將3種重組和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293A 細胞，通過免疫熒光(IF)試驗，在熒光顯微鏡 Cy5 熒光通道下觀察，結(jié)果如圖 8 所示，A、B、C 組可見較亮熒光且細胞形態(tài)清晰，D 組未見熒光，說明 A、B、C 組質(zhì)粒在細胞中成功表達，D 組無特異性蛋白表達。由此說明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，成功在 HEK293A 細胞中定位。

2.9 CCK-8法評估重組質(zhì)粒對細胞活性的影響將 3 種重組質(zhì)粒、空載質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑依照 25，50，100，200 μg/L 4個質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)染 HNK293 細胞，轉(zhuǎn)染試劑組作為對照組。結(jié)果如果圖 9 所示(圖 A～D，分別為轉(zhuǎn)染 24,28,72 h 結(jié)果)，轉(zhuǎn)染后 24,48,72 h 后，不同質(zhì)量濃度質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的活率差異顯著(P<0.05)，相同質(zhì)量濃度組間差異不顯著(P>0.05)。隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒質(zhì)量濃度及轉(zhuǎn)染試劑的增加，細胞活率降低，且空載組和轉(zhuǎn)染試劑組出現(xiàn)相同規(guī)律。由以上結(jié)果分析可知，重組質(zhì)粒對細胞無損傷作用，細胞活率降低由轉(zhuǎn)染試的增加導致，且隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞自身生存活性降低，增加轉(zhuǎn)染試劑的量，進一步影響細胞活率，72 h 時細胞活率最低。

圖9 CCK-8 試驗結(jié)果

3 討論

豬胸膜肺炎和豬肺疫是豬場常見的呼吸道系統(tǒng)傳染病，這 2 種疾病的致病性及臨床表現(xiàn)相似，常呈混合感染并難以區(qū)分均是一種以呼吸道癥狀為主的傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。 有研究顯示，目前已報道的商品化疫苗，在保護以上兩種疾病的感染并未取得令人滿意的效果，最新的研究主要集中在尋找所有血清型中高度保守的抗原，可以作為亞單位疫苗研究的候選者，同時克服弱毒疫苗的突變及毒力反強的問題[13]。

A.GV658-OmpH;B.GV658-Apx IVA;C.GV658-New;D.空白對照圖8 重組質(zhì)粒在細胞中的免疫定位

多項研究證明了APP的Apx毒素在抵抗豬胸膜肺炎的保護性免疫中的重要性，針對Apx 毒素的中和抗體可以保護嗜中性粒細胞免于被殺死，從而使其能夠有效清除侵入的細菌[14]。 Apx Ⅳ 存在于APP所有血清型中，有研究報道可使血清抗體效價較其他外毒素明顯增加， 攻毒試驗可提供完全保護[1]；OmpH是Pm最主要的外膜蛋白，其即能誘導機體產(chǎn)生同源保護 有能產(chǎn)生異源保護，可有效誘導動物產(chǎn)生特異抗體，從而發(fā)揮免疫保護作用[15]。因此，本研究選取Apx Ⅳ和OmpH作為研究對象。

表位是宿主免疫系統(tǒng)識別抗原的關(guān)鍵區(qū)域，優(yōu)勢抗原表位的篩選是當前疫苗研發(fā)的新策 略。本研究中所篩選構(gòu)建的New肽段，經(jīng)在線軟件預測具有較好抗原性，可作為疫苗研究的候選者，同時構(gòu)建的3中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HNK239細胞后，均可正常表達，且重組質(zhì)粒對HNK293 細胞均無明顯損傷作用，隨著濃度及時間的增加與對照組相比無明顯差異，高濃度組質(zhì)粒細 胞存活率較低濃度組低，可能由于轉(zhuǎn)染試劑對應增加的影響導致。此結(jié)果的順利獲得，因構(gòu) 建載體加入GFP熒光標簽，有利于評估質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)染；3段序列N末端均添加Flag標簽， 可間接評估蛋白表達情況。本研究所構(gòu)建的3種質(zhì)粒可成功表達且對HNK293細胞無明顯損 傷，因此，可利用以上3種質(zhì)粒構(gòu)建APP與Pm二聯(lián)亞單位疫苗，對傳染性胸膜肺炎與豬肺疫的防控具有一定的臨床應用價值。