牛呼吸道病毒多重PCR檢測方法的建立及應用

魏碩佟，謝 婧，熊新雪，馬佳睿，李瑞乾，繆西鵬，許立華

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是一種多因素傳染病，在奶牛與肉牛中都較為常見。其特征是具有復雜的感染病原學[1-2]，嚴重影響奶牛及肉牛的生產性能，也嚴重危害了養牛行業的健康發展。病毒感染是引起呼吸道疾病的重要因素，主要病原包括牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛副流感病毒 3 型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)等。在病原體感染、環境、運輸等相關因素的相互作用下[3-4]，BRDC極易給養殖業造成巨大的經濟損失，因此，加強對其病原的快速檢測具有重大意義。

BVDV為黃病毒科、瘟病毒屬的有囊膜單股RNA病毒。BVDV在全球范圍均有檢出[5]，在中國檢出率可達53%[6]。IBRV為泛嗜性病毒，屬于皰疹病毒科的有囊膜DNA病毒，可引起多種疾病，包括呼吸道疾病、生殖疾病、晚期流產以及牛的神經和全身疾病等，國內綜合檢出率約為40%[7]。BRSV屬于副黏病毒科、肺病毒屬，是有囊膜的單股負鏈RNA。BRSV在世界上廣泛分布，包括美國、意大利、伊朗、巴西、厄瓜多爾等國家均有流行[8-12]。BCoV為冠狀病毒科、冠狀病毒屬有囊膜的單股正鏈RNA病毒，大小為80～160 nm，是最大的RNA病毒之一，易造成成年奶牛冬季痢疾和犢牛呼吸道及胃腸道疾病[13]。BPIV3是不分節段的單股負鏈RNA病毒，有囊膜，屬于副黏病毒科、呼吸道病毒屬，可感染人、牛、水牛、羊等多種哺乳動物[14]。

多重PCR檢測方法相較于傳統檢測方法具有可同時檢測多種病原、操作簡便、靈敏度高及經濟便捷等優點。本試驗建立檢測牛呼吸道病毒包括BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的多重PCR方法，并在寧夏地區規模化養殖場采集鼻拭子樣品進行檢測，以期為牛呼吸道病毒病的檢測、流行病學調查及綜合防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis、S.aureus陽性樣品均由本實驗室鑒定保存。2019年9月至2020年11月，自寧夏地區各規模化牛場采集疑似病牛的186份鼻拭子樣品。

1.2 主要試劑和儀器設備病毒DNA/RNA提取試劑盒SE Viral DNA/RNA Kit、膠回收試劑盒Gel Extraction Kit和質粒小提試劑盒Plasmid Mini Kit均為OMEGA公司產品；PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit為TaKaRa公司產品；Taq DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple載體、Trans1-T1感受態均為全式金公司產品；DL1200 DNA Marker為天根公司產品；PCR儀為BIO-RAD公司產品。

1.3 引物設計利用Primer Premier 5.0軟件， 根據NCBI中已公布的BVDV的5′UTR、IBRV的gB基因、BRSV的N基因、BCoV的N基因、BPIV3的HN基因保守區域分別設計引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息和目的片段預計擴增大小見表1。

表1 引物信息和目的片段預計擴增大小

1.4 核酸提取所有陽性樣品和待檢樣品參照提取試劑盒提取病毒DNA/RNA，-20℃保存病毒DNA，-80℃保存病毒RNA。參照反轉錄試劑盒將病毒RNA進行反轉錄，獲得cDNA后于-20℃保存。

1.5 重組質粒標準品的制備將獲得的病毒DNA和cDNA作為模板，利用設計好的引物進行PCR擴增。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照膠回收試劑盒回收并純化PCR產物，分別與pEASY-Blunt Simple載體連接，轉化至Trans1-T1感受態，最終獲得重組質粒并測序鑒定。將測序結果正確的重組質粒分別命名為pEASY-BVDV、pEASY-IBRV、pEASY-BRSV、pEASY-BCoV、pEASY-BPIV3，并測定質粒濃度，計算拷貝量。

1.6 多重PCR反應條件的優化對退火溫度(53～65℃)、引物濃度(0.05 ～0.4 μmol/L)、Mg2+濃度(2 ～5 mmol/L)、酶濃度(1～3 U)等反應條件進行優化。

1.7 特異性試驗用優化后的多重PCR檢測方法對BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis和S.aureus進行檢測，并用ddH2O作為陰性對照，以驗證檢測方法的特異性。

1.8 敏感性試驗將5種陽性重組質粒分別按梯度稀釋(101～109拷貝/μL)，并作為模板，以檢測多重PCR方法的最低檢測限。

1.9 重復性試驗用優化后的多重PCR檢測方法對陽性重組質粒進行重復性試驗。

1.10 多重PCR檢測方法的應用利用所建立的多重PCR檢測方法對實驗室采集的186份鼻拭子樣品進行檢測，并與單重PCR檢測方法進行對照。

2 結果

2.1 多重PCR最佳退火溫度的確定建立50 μL反應體系：Taq酶 1 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，模板各0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 45 s,72℃ 90 s,30個循環;72℃ 5 min。其中退火溫度設定為53,53.8,55.4,57.7,60.6,63,64.3,65℃。結果顯示，各退火溫度均能擴增出目的條帶(圖1)。最終根據設計引物的T值，選取最佳退火溫度為53.8℃。

M.DL1200 DNA Marker；1～8.分別為退火溫度由53～65℃每2℃依次遞增的PCR產物圖1 退火溫度優化

2.2 多重PCR最佳引物濃度的確定將體系中各引物濃度由0.05 ～0.4 μmol/L每0.05 μmol/L依次遞增，退火溫度設定為53.8℃，其他條件不變，選取條帶中最清晰且各引物用量最少的濃度，最終確定最佳引物濃度為0.2 μmol/L(圖2)。

M.DL1200 DNA Marker；1～8.分別為引物終濃度由0.05～0.4 μmol/L每0.05 μmol/L依次遞增的PCR產物圖2 引物濃度優化

2.3 多重PCR最佳Mg2+濃度的確定將體系中Mg2+濃度由2～5 mmol/L每0.5 mmol/L依次遞增，退火溫度設定為53.8℃，引物用量為0.2 μmol/L，其他條件不變，選取條帶中最清晰且Mg2+用量最少的濃度，最終確定最佳Mg2+濃度為2 mmol/L(圖3)。

M.DL1200 DNA Marker；1～7.分別為Mg2+濃度由2～5 mmol/L每0.5 mmol/L依次遞增的PCR產物圖3 Mg2+濃度優化

2.4 多重PCR最佳酶濃度的確定將體系中酶濃度由1～3 U每0.25U依次遞增，退火溫度設定為53.8℃，引物用量為0.2 μmol/L，Mg2+濃度為2 mmol/L，其他條件不變，選取條帶中最清晰且酶用量最少的濃度，最終確定最佳酶濃度為2.25U(圖4)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分別為酶濃度由1～3 U每0.25U依次遞增的PCR產物圖4 酶濃度優化

通過對退火溫度、引物濃度、Mg2+濃度及酶濃度等條件的優化，最終確定最佳反應體系為：Taq酶 0.75 μL(終濃度為2.25 U)，10×buffer 5 μL(Mg2+終濃度)，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，模板各0.5 μL，上、下游引物各1 μL(終濃度為0.2 μmol/L)，ddH2O補足50 μL。最佳反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 5 min。

2.5 特異性試驗用優化后的多重PCR檢測方法檢測不同陽性樣品。結果顯示，僅BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3能擴增出特異性條帶且與目標大小一致，其他病毒或細菌均未擴增出條帶，表明該方法具有良好的特異性(圖5)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分別為BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis、S.aureus的PCR產物；10.陰性對照圖5 特異性試驗

2.6 敏感性試驗將重組質粒pEASY-BVDV、pEASY-IBRV、pEASY-BRSV、pEASY-BCoV、pEASY-BPIV3分別梯度稀釋至101～109拷貝/μL，并作為多重PCR模板。結果顯示，多重PCR方法對BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低檢測限分別為103,103,104,103,104拷貝/μL(圖6)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分別為模板濃度101 ～109 拷貝/μL的PCR產物；10.陰性對照圖6 敏感性試驗

2.7 重復性試驗用建立的多重PCR檢測方法對重組質粒模板進行檢測，3次檢測結果一致(圖7)。表明該方法具有良好的重復性。

A～C.PCR擴增結果；M.DL1200 DNA Marker；1～6.分別為多重、BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV的PCR產物；7.陰性對照圖7 重復性試驗

2.8 應用性試驗用建立的多重PCR檢測方法對186份鼻拭子樣品進行檢測，并與單重PCR檢測結果進行對照，其中多重PCR檢測結果表明，BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3陽性檢出率分別為8.06%(15/186)、10.75%(20/186)、15.05%(28/186)、16.67%(31/186)、7.53%(14/186)，并檢出感染2種病原的樣品4份(檢出率為2.15%)，感染3種病原的樣品3份(檢出率為1.61%)，感染4種病原的樣品6份(檢出率為3.23%)，感染5種病原的樣品4份(檢出率為2.15%)，與單重PCR檢測結果符合率為100%(表2)，證明該方法能準確診斷牛呼吸道病毒混合感染。

表2 臨床樣品檢測結果

3 討論

BRDC病因復雜，與病原體感染、環境及飼養管理[15]等因素相互作用有關，因此，快速準確的診斷是防控BRDC的關鍵。多重檢測方法相較于傳統檢測方法具有能同時檢測多種病原、快速簡便等優點，尤其適用于BRDC這類由于多種病原引起的疾病。國內外學者也建立了許多相關檢測方法。PANSRI等[16]建立了一種多重qPCR試劑盒，可對5種引起牛呼吸道疾病的病毒同時進行檢測和定量，可作為一種檢測和定量相關病原體的新工具。THANTHRIGE-DON等[17]將基因芯片和多重PCR反應結合，建立了一種多重PCR-電子微陣列分析方法，能夠檢測和區分BRDC相關的4種細菌(溶血曼海姆菌、組織希氏菌、多殺性巴氏桿菌和牛支原體)和5種病毒(BVDV、IBRV、BRSV、BPIV3和BCoV)，是單一樣品中檢測和區分多種病原體的有力工具。

本試驗建立的多重PCR檢測方法對BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低檢測限分別為103，103，104，103，104拷貝/μL，具有良好的敏感性。該方法能從臨床樣品中檢測出5種病毒，與單重PCR檢測結果一直，表明該方法可用于臨床中的診斷。同時，對于2～5種病原混合感染檢出率分別為2.15%，1.61%，3.23%，2.15%，表明寧夏地區牛群中存在多種病原混合感染情況。

本試驗通過優化退火溫度、引物濃度、Mg2+濃度、酶濃度等反應條件，建立了一種同時檢測BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3 這5種牛呼吸道病毒的多重PCR檢測方法。該方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點，可以成功從采集的疑似感染牛鼻拭子中檢測到5種病原，為牛呼吸道病毒的單一診斷及混合感染診斷提供技術支持，也為相關流行病學研究提供參考。