檢測雞傳染性支氣管炎病毒GVI-1基因型毒株的實時熒光定量PCR方法建立

陳淑琴，杜旭彬，鄢 坤，廖 凱，張成成，郭夢嬌，吳艷濤，張小榮

(揚州大學 獸醫學院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是雞的一種急性、病毒性疾病，主要侵害呼吸和泌尿生殖系統。該病在世界范圍內廣泛流行，給養雞業帶來了嚴重的經濟損失[1]。傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬中的γ冠狀病毒,極易發生遺傳變異，導致新的基因型和血清型不斷出現，使得病毒檢測和免疫預防日益復雜化[2-3]。

2016年，VALASTRO等[4]基于對全球不同地區報道的1 518個IBV分離株S1基因序列系統發育分析的結果，提出了一種統一的IBV基因分型系統，將目前已知的IBV毒株分為6個基因型(GI～GVI)和32個進化譜系，其中GI基因型包括GI-1～GI-27等27個譜系，而GII～GVI每個基因型均只有1個譜系。研究表明，我國IBV流行情況較為復雜，且不同時期流行的優勢基因型存在較大的差異，如GI-19型(也稱QX型)即為當前流行的最優勢的基因型(約占70%)，此外還存在GI-7型(也稱TWI型)和GVI-1(也稱TC07-2型)等其他一些常見基因型[5]。其中GVI-1基因型(又稱TC07-2型)IBV是最新出現的1種基因型，于2007年在廣東首次分離鑒定，隨后在亞洲其他一些國家相繼出現[6-7]。流行病學監測結果顯示近年來GVI-1基因型IBV毒株分離率呈持續上升趨勢，尤其在我國南方地區的流行更為普遍，應當引起足夠重視[8-9]。目前對分離株進行基因分型需要首先克隆S1基因并進行測序，然后通過基因序列比對和遺傳進化分析確定對應的基因型，操作繁瑣且周期較長。本研究的目的是建立1種可特異性檢測GVI-1基因型IBV的實時熒光定量PCR(qPCR)檢測方法，為GVI-1基因型IBV流行病學監測和臨床分離株的快速分型提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 毒株本研究所用GI-1、GI-7、GI-13、GI-19、GI-28和GVI-1等不同基因型IBV分離株和疫苗株，具體信息見表1。其中分離株CK/CH/JX/2018/1株和CK/CH/AH/2011/3株由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存[10]；QXL87疫苗株由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室研制、保藏和提供[11]；H120株、Ma5株、LDT3-A株和4/91株均為從商品化疫苗中分離獲得。

表1 不同基因型IBV毒株信息

1.2 試劑超純RNA提取試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒及AxyPrep質粒DNA小量提取試劑盒均購自康寧生命科學(吳江)有限公司；pEASY?-T3克隆載體質粒、Trans1-T1感受態細胞、反轉錄試劑盒、EasyTaq?DNA Polymerase、瓊脂糖等均購自北京全式金生物技術有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物探針的設計與合成從GenBank中下載目前在中國流行的IBV主要基因型代表毒株和疫苗毒株S1基因序列，采用Lasergene 7.0軟件包中的Megalign軟件對其S1基因序列進行比對分析，選取在不同基因型間序列差異較大且在基因型內不同毒株間較為保守的區域進行引物和探針的設計，并通過在線Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)驗證其特異性。為分析建立的檢測方法對GVI-1基因型IBV毒株的通用性，將從GenBank中下載已發表的GVI-1基因型IBV毒株基因序列與本研究設計的引物探針通過SnapGene軟件進行序列比對，毒株信息見表2。引物和探針委托南京金斯瑞生物科技公司合成。

表2 GVI-1基因型IBV毒株信息

1.4 質粒標準品的制備使用超純RNA提取試劑盒提取GVI-1基因型IBV JX-2018-1株的尿囊液總RNA，并參照TransScript?Reverse Transcriptase [M-MLV,RNaseH-]操作步驟將其反轉錄為cDNA。對獲得的cDNA用設計的上、下游引物進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后膠回收目的片段，克隆到pEasy?-T3載體后將PCR鑒定為陽性的重組質粒送至通用生物系統(安徽)有限公司測序。測序正確的菌液提質粒，用紫外分光光度計進行質粒濃度測定，并根據公式N=(C×10-9)/(M×660)×6.02×1023(C為質粒濃度，M為構建質粒的堿基數)計算質粒拷貝數[12]。

1.5 標準曲線的建立將質粒標準品10倍梯度稀釋為1.0×101～ 1.0×1010拷貝/μL，每個稀釋度分別取2 μL作為qPCR的模板進行擴增。反應體系為20 μL，包括以下組分：0.4 μL上游引物(10 μmol/L)、0.4 μL下游引物(10 μmol/L)、0.2 μL熒光探針(10 μmol/L)、10 μL 2×qPCR Probe Master Mix、2 μL cDNA模板和7 μL ddH2O。反應條件為95℃ 5 min；95℃ 10 s、60℃ 30 s，40個循環。由儀器自動生成標準曲線及擴增方程式。

1.6 敏感性試驗將10倍梯度稀釋的質粒標準品分別進行qPCR檢測，并以無菌水作陰性對照，以確定該方法可檢測到的最低拷貝數，同時用與qPCR試驗一致的上、下游引物進行普通PCR擴增，比較2種方法的敏感性差異。

1.7 特異性試驗分別從含有JX/2018/1、AH/2011/3、QXL87、H120、Ma5、LDT3-A和4/91株的雞胚尿囊液中提取病毒總RNA，反轉錄獲得cDNA模板后進行qPCR反應，每個樣品做3個重復，以驗證該檢測方法的特異性。

1.8 重復性試驗取濃度為1.0×105～1.0×107拷貝/μL的3個梯度的標準質粒為模板，通過qPCR方法進行組內重復試驗，每個梯度設3個重復；將3個梯度的標準質粒分成3個批次，在相同反應條件下做3次獨立反應。計算Ct值的平均值和變異系數(CV)，分析試驗的可重復性。

1.9 樣品檢測將本實驗室采集的60份JX/2018/1毒株人工感染雛雞的咽拭子和30份SPF雞咽拭子提取RNA，經反轉錄獲得cDNA模板后分別通過本研究建立的qPCR方法和常規PCR方法進行檢測，比較2種方法的檢測結果。

2 結果

2.1 引物和探針的設計根據S1基因序列比對分析結果設計的引物、探針及其結合位置如圖1和表3所示，探針5′端標記熒光報告基團為FAM，3′端標記熒光淬滅基團為MGB。序列比對結果顯示，探針引物可與所有GVI-1基因型IBV毒株基因序列特異性結合，說明建立的檢測方法適用于該型病毒的鑒別檢測。

表3 本研究所用探針及引物

圖1 不同基因型IBV毒株S1基因比對結果和引物、探針結合位置

2.2 質粒標準品的制備以GVI-1基因型IBV JX/2018/1株基因組cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，擴增產物約為91 bp，與預期結果相符(圖2)。將擴增的目的片段克隆到pEASY?-T3載體后測序結果與GenBank中GVI-1基因型IBV S1基因相應片段的堿基序列完全一致。用紫外分光光度計對抽提的質粒進行濃度測定，配制終濃度為1.0×1010拷貝/μL的質粒備用。

M.DL500 DNA Marker；1.PCR擴增產物;2.陰性對照圖2 目的基因片段PCR擴增結果

2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立將質粒標準品10倍梯度稀釋為1.0×101～ 1.0×1010拷貝/μL，分別取每個稀釋度的標準質粒為模板進行qPCR擴增，反應結束后系統自動生成標準曲線如圖3所示。方程為y=-3.42x+37.36,相關系數(R2)為0.999。

圖3 實時熒光定量PCR標準曲線

2.4 敏感性試驗qPCR結果顯示，該方法最低檢測限可達1.0×101拷貝/μL，在1.0×101～1.0×1010拷貝/μL范圍內可得到良好的動力學曲線(圖4)，而常規PCR檢測極限為1.0×103拷貝/μL(圖5)。表明本研究建立的qPCR方法比普通PCR方法敏感性提高了約100倍。

1010～101.質粒標準品濃度分別為1.0×101 ～1.0×1010 拷貝/μL圖4 實時熒光定量PCR敏感性試驗擴增曲線

M.DL500 DNA Marker；1～10.1.0×101 ～1.0×1010拷貝/μL質粒模板圖5 普通PCR敏感性試驗

2.5 特異性試驗提取不同基因型IBV毒株雞胚尿囊液中的RNA，以其反轉錄獲得的cDNA為模板進行qPCR。結果顯示，僅GVI-1基因型IBV毒株出現特異性擴增曲線，而陰性對照和其他基因型毒株未出現擴增信號(圖6)。

2.6 重復性試驗重復性試驗結果(表4)顯示，該qPCR檢測方法組內重復性試驗的CV為1.06%～2.44%，組間重復性試驗的CV為0.45%～2.29%，均小于2.5%，說明該方法具有良好的重復性與穩定性。

1.GVI-1基因型IBV毒株；2～8.分別為陰性對照和其他基因型毒株圖6 實時熒光定量PCR特異性試驗擴增曲線

表4 重復性試驗結果

2.7 樣品檢測利用建立的qPCR方法對采集的60份JX/2018/1毒株人工感染雛雞的口腔和泄殖腔棉拭子進行檢測，同時與常規PCR方法的檢測結果進行比較,結果顯示,對30份采集自SPF雞的咽拭子樣品兩種方法檢測均為陰性；在60份采集自攻毒雞的咽拭子樣品中，qPCR方法檢測出56份陽性，陽性檢出率為93.3%，常規PCR檢測出45份陽性，陽性檢出率為75%，兩者的符合率為96.7%。

3 討論

我國IB發病情況復雜，目前常用的IBV檢測方法包括病毒的分離與鑒定、血清學和分子生物學等檢測方法[13]，但這些方法普遍無法區分不同基因型IBV的感染。基因分型是IBV毒株最常用的分類方法，確定野毒株的基因型對IBV的流行病學監測至關重要，同時可以為選擇合適的疫苗提供信息。IBV基因型的鑒定通常依賴于S1基因的系統發育分析，但該方法耗時長且工作量大，無法滿足快速分型的需求；而qPCR技術敏感度高，特異性強、反應迅速，并能夠進行定量分析，目前已應用于GI-1、GI-9、GI-11和GI-16等基因型IBV的鑒別檢測[14-15]。

本研究采用TaqMan MGB熒光探針法，選取在不同基因型毒株間S1基因序列差異較大的區域設計特異性引物和探針，建立GVI-1基因型IBV實時熒光定量PCR檢測方法。敏感性試驗結果表明，所建立的檢測方法對質粒標準品的檢測下限可達1.0×101拷貝/μL，靈敏度高于普通PCR方法100倍。特異性試驗結果表明，該方法能夠特異性檢測出GVI-1基因型IBV毒株，并且不與GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-28等其他基因型毒株和疫苗株發生交叉反應，對GVI-1基因型IBV臨床分離株的快速篩查具有重要意義。重復性試驗結果顯示，該方法組內和組間重復試驗的CV均小于2.5%，穩定性良好。以本研究建立的熒光定量PCR方法和常規PCR方法對人工感染雛雞的口腔和泄殖腔棉拭子進行檢測，結果顯示，2種方法的符合率高達96.7%，且qPCR敏感性更高，同時可縮短檢測時間、提高檢測效率。本研究建立的GVI-1基因型IBV實時熒光定量PCR檢測方法對GVI-1基因型IBV的監測以及病毒早期感染的診斷分析方面提供了可靠的技術手段。