引起肉種雞產(chǎn)蛋下降的新型坦布蘇病毒的分離和鑒定

劉 東，劉紅祥，劉秋云，任衍倍，李 彬，劉建濤，王群義，劉 平，宋姍姍，杜元釗

(青島易邦生物工程有限公司 動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266032)

2010年4月以來(lái)，在我國(guó)浙江、福建、上海、山東等養(yǎng)鴨集中區(qū)，陸續(xù)暴發(fā)了一種以蛋鴨、種鴨采食、產(chǎn)蛋大幅度下降，肉鴨、成鴨、肉鵝等共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病，經(jīng)鑒定病原為坦布蘇病毒，該病毒傳播迅速、蔓延范圍廣，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大損失[1-4]。隨著疫病的發(fā)展，坦布蘇病毒易感宿主逐漸擴(kuò)大，不僅可以感染水禽鴨、鵝，也可以感染雞、鴿子、麻雀等，研究表明，蛋雞也可感染坦布蘇病毒并引起產(chǎn)蛋下降。陳仕龍等[5]從產(chǎn)蛋下降的蛋雞群分離到坦布蘇病毒，動(dòng)物回歸試驗(yàn)也表明坦布蘇病毒可以導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋下降。張敬峰等[6]也從臨床表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的蛋雞群鑒定到1株坦布蘇病毒。

近年來(lái)坦布蘇病毒感染家禽現(xiàn)象逐漸增多且有蔓延趨勢(shì)，本研究首次從我國(guó)產(chǎn)蛋下降的肉種雞群中分離到新型坦布蘇病毒，并通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明新型坦布蘇病毒可以引起肉種雞群產(chǎn)蛋下降。因此開(kāi)展新型坦布蘇病毒的流行病學(xué)調(diào)查對(duì)該病的防控和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。同時(shí)本研究通過(guò)對(duì)新型坦布蘇病毒流行病學(xué)調(diào)查，在病毒特性、遺傳譜系、血清學(xué)感染規(guī)律、動(dòng)物攻毒試驗(yàn)方面取得初步進(jìn)展，為新型坦布蘇病毒的疫苗研究和疫病防控等提供大量數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源病料、血清來(lái)自廣東、江蘇、湖北、廣西、福建等地出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的肉種雞場(chǎng)。

1.2 試劑與耗材PCR試劑和Marker為T(mén)aKaRa產(chǎn)品；RT-PCR試劑為湖南艾克瑞產(chǎn)品；50 X TAE buffer為上海生工產(chǎn)品；Goldview核酸染料為labest產(chǎn)品；瓊脂糖為康為世紀(jì)產(chǎn)品；核酸提取試劑盒為杭州博日產(chǎn)品；ELISA試劑盒來(lái)自上海獸醫(yī)研究所、美國(guó)(IDEXX)愛(ài)德士公司等。

1.3 儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器)；離心機(jī)(eppendorf)；核酸提取純化儀(杭州博日)；電泳儀(北京六一)；凝膠成像儀(上海培清科技)；移液器(eppendorf)；生化培養(yǎng)箱(上海精宏)。

1.4 細(xì)菌分離無(wú)菌采集發(fā)病場(chǎng)雞只肝臟、卵巢、輸卵管等組織樣本接種胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA+血清)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)。

1.5 分子生物學(xué)

1.5.1PCR和RT-PCR檢測(cè) 采集臨床出現(xiàn)降蛋雞只的氣管、肝臟、脾臟、腎臟等組織，剪碎、研磨、凍融、離心處理，采用全自動(dòng)核酸提取試劑盒進(jìn)行組織DNA和RNA的提取，分別設(shè)計(jì)雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感病毒、坦布蘇病毒的引物進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列與擴(kuò)增片段大小以及目的基因見(jiàn)表1。

表1 引物序列和擴(kuò)增目的片段大小以及目的基因

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠成像儀觀(guān)察和記錄結(jié)果。

1.5.2坦布蘇病毒E基因克隆測(cè)序分析 將1.5.1檢測(cè)疫病中的陽(yáng)性目的條帶進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單個(gè)白色菌落，37℃搖床培養(yǎng)8 h以上，經(jīng)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性菌液，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，序列比對(duì)采用MegAlign程序,進(jìn)化樹(shù)采用鄰接法(MEGA6.0軟件)構(gòu)建。

1.6 病毒分離

1.6.1SPF雞胚分離 將送檢的組織樣本剪碎、研磨、凍融、離心(12 000 r/min，10 min)后取上清，經(jīng)0.22 μm的濾器過(guò)濾后，通過(guò)絨毛尿囊膜接種9日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚0.2 mL，每日照胚，若雞胚死亡，觀(guān)察胚體變化，收獲胚體和尿囊液經(jīng)處理后繼續(xù)傳代，連傳3代；若雞胚未死亡，則在第6天采集胚體、尿囊液等經(jīng)處理后繼續(xù)傳代，連傳3代。對(duì)收取的尿囊液和胚體采用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒。

1.6.2細(xì)胞分離 采用CEF、DF-1細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分離，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%后按2%接種1.6.1中經(jīng)0.22 μm的濾器過(guò)濾后的上清，每日觀(guān)察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，進(jìn)行傳代，連傳3代；若無(wú)細(xì)胞病變則每3 d傳代1次，連傳3代。收取F3代細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒。

1.7 血清學(xué)檢測(cè)

1.7.1ELISA檢測(cè) 采集不同地域的發(fā)病雞群、假定健康群、育成階段等肉種雞群的血清，采用坦布蘇病毒抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將待檢血清進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)】乖话?，將稀釋后的血清、陰性?duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，按照每孔0.1 mL加入到抗原包被板中，置于37℃溫箱中孵育1 h；棄去孔中液體，加入洗滌液0.3 mL，作用3 min，棄去洗滌液，重復(fù)3次；每孔加入單克隆抗體0.1 mL，37℃孵育1 h；棄去孔中液體，加入洗滌液0.3 mL，作用3 min，棄去洗滌液，重復(fù)3次；每孔加入TMB底物溶液0.1 mL，輕搖2 s，室溫下避光顯色10 min；每孔加入終止液0.05 mL，置酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔D值。

1.7.2HI檢測(cè) 采集不同地域的不同發(fā)病階段雞群、假定健康群、育成階段等肉種雞群的血清按照獸藥典(2015)進(jìn)行ND、H9、H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-3抗體的檢測(cè)，測(cè)定發(fā)病前后HI抗體變化情況。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)將SPF產(chǎn)蛋雞采用口服、肌注、點(diǎn)眼的方式感染1.7.1中分離到的F3代坦布蘇病毒,每種方式0.4 mL，接種20只;同種方式采用生理鹽水設(shè)置對(duì)照組，在無(wú)菌隔離器中飼養(yǎng),每天統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋及蛋質(zhì)量情況，連續(xù)觀(guān)察20 d。攻毒組和對(duì)照組于攻毒后第7和14天各取2只剖殺,觀(guān)察剖檢病變并采集病料采用RT-PCR方法進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測(cè)，同時(shí)在第3，7，14天采集喉頭和泄殖腔棉拭子采用RT-PCR方法進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果將不同地域送檢的組織樣本(肝臟、卵巢、輸卵管)等病料接種胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA+血清)，培養(yǎng)48 h，無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)(表2)。

表2 送檢樣本細(xì)菌分離結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)結(jié)果

2.2.1PCR和RT-PCR結(jié)果 對(duì)臨床出現(xiàn)疑似降蛋的肉種雞群，無(wú)菌采集樣本(氣管、肝臟、脾臟、腎臟)利用PCR和RT-PCR方法進(jìn)行雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒的檢測(cè)，結(jié)果從廣東、廣西、福建、湖北、江蘇等地疑似發(fā)病的肉種雞組織樣本中均檢測(cè)到坦布蘇病毒，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，陽(yáng)性率為20%～41.6%(表3)。對(duì)以上地區(qū)育成階段雞群采集樣本檢測(cè)坦布蘇病毒均為陰性(表4)，以上發(fā)病群樣本與育成階段未發(fā)病群樣本均未檢測(cè)到雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)等病毒。

表3 發(fā)病雞群坦布蘇病毒檢測(cè)果 份

表4 育成階段雞群坦布蘇病毒檢測(cè)結(jié)果 份

2.2.2坦布蘇病毒E基因克隆測(cè)序分析結(jié)果 將坦布蘇病毒陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，與參考毒株(表5)進(jìn)行比對(duì)分析。E基因核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果表明，本研究從肉種雞上分離到的坦布蘇病毒的同源性彼此為97.6%～99.3%，與泰國(guó)毒株的同源性最高，為97.0%～98.8%，與中國(guó)Ⅰ分支參考毒株的同源性為86.2%～88.3%，與中國(guó)Ⅱ分支參考毒株的同源性為86.9%～89.3%，與馬來(lái)西亞Ⅰ分支參考毒株的同源性為87.4%～88.9%，與馬來(lái)西亞Ⅱ分支參考毒株的同源性為86.1%～88.7%(表6)。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離到的坦布蘇病毒單獨(dú)處于一個(gè)亞分支，并與泰國(guó)參考毒株處于一個(gè)大分支，與馬來(lái)西亞和中國(guó)參考毒株分別屬于不同的分支(圖2)。

圖2 坦布蘇病毒E基因核苷酸進(jìn)化樹(shù)分析

表5 本研究所用坦布蘇病毒參考序列

表6 本研究分離的坦布蘇病毒與參考毒株核苷酸同源性 %

M.DL2000的Marker;6,11,12,16,21,24,27,29,33,36,40,42,44,45,50,54,62,64,68,69,73,77號(hào).樣本為陽(yáng)性;80號(hào).為陰性對(duì)照;81號(hào).為陽(yáng)性對(duì)照。圖1 坦布蘇病毒電泳結(jié)果

2.3 病毒分離結(jié)果

2.3.1SPF雞胚分離結(jié)果 送檢組織接種9日齡SPF雞胚，F(xiàn)1代部分雞胚在接種5 d后出現(xiàn)死亡，隨著培養(yǎng)代次的增加，雞胚死亡時(shí)間逐步提前(表7)。觀(guān)察胚體變化，死亡雞胚胚體發(fā)育小、充血，爪子干癟僵挺，絨毛尿囊膜發(fā)白增厚(圖3)。分別收取胚體和尿囊液，采用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒，結(jié)果F1-F3代中胚體和尿囊液均檢測(cè)到坦布蘇病毒陽(yáng)性，未檢測(cè)到雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)。

圖3 胚體病變(左)及絨毛尿囊膜病變(右)

表7 SPF雞胚病毒分離結(jié)果

2.3.2細(xì)胞分離 將送檢樣本接種DF-1細(xì)胞，結(jié)果DF-1細(xì)胞在接種96 h后出現(xiàn)病變，細(xì)胞聚堆，圓縮，死細(xì)胞增多，隨著病變?cè)龆?，?xì)胞裂解(圖4)。對(duì)F3代細(xì)胞培養(yǎng)液采用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、滑液囊支原體、禽流感(H9N2)、坦布蘇病毒，結(jié)果除檢測(cè)到坦布蘇病毒陽(yáng)性外，其他均為陰性。

圖4 培養(yǎng)96 h后(左)及120 h后(右)的細(xì)胞病變

2.4 血清學(xué)結(jié)果

2.4.1ELISA檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA檢測(cè)方法，對(duì)疑似降蛋雞群采集血清進(jìn)行坦布蘇病毒抗體的檢測(cè)，結(jié)果顯示坦布蘇病毒抗體陽(yáng)性率為6.67%～32.6%(表8)；同時(shí)采集以上地區(qū)場(chǎng)內(nèi)假定健康群與育成階段雞群血清，坦布蘇病毒抗體顯示陽(yáng)性率明顯偏低，為0～6.6%(表9，10)。

表8 發(fā)病肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

表9 假定健康群肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

表10 育成階段肉種雞群坦布蘇病毒抗體結(jié)果 份

2.4.2HI結(jié)果 采用HI檢測(cè)方法，對(duì)送檢的不同時(shí)間段發(fā)病群血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果ND、H9、H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-3等抗體無(wú)顯著變化，無(wú)異常。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果將分離到的坦布蘇病毒感染SPF產(chǎn)蛋雞,結(jié)果攻毒組在攻毒后第1～8天的產(chǎn)蛋量明顯低于對(duì)照組，并于攻毒后第9～20天停止產(chǎn)蛋，對(duì)照組產(chǎn)蛋正常(圖5)。

圖5 試驗(yàn)期間攻毒組和對(duì)照組產(chǎn)蛋情況

與第7和14天每組各解剖2只，顯示攻毒組和對(duì)照組均無(wú)明顯病理病變，分別采集攻毒組雞只各組織進(jìn)行帶毒分析，結(jié)果顯示攻毒后7 d除了氣管與肺臟檢測(cè)陰性外其他組織均檢測(cè)到坦布蘇病毒，攻毒后14 d各組織均未檢測(cè)到坦布蘇病毒(表11)。

表11 各組織帶毒情況

在攻毒后第3,7,14天分別采集喉頭和泄殖腔棉拭子進(jìn)行坦布蘇病毒的檢測(cè)，結(jié)果顯示第3天喉頭與泄殖腔檢測(cè)坦布蘇病毒均為陰性，第7天喉頭和泄殖腔多數(shù)檢測(cè)到坦布蘇病毒陽(yáng)性(陽(yáng)性率80%～100%)，第14天喉頭和泄殖腔拭子均為陰性(表12)，與組織中坦布蘇病毒帶毒規(guī)律一致。

表12 攻毒期間雞群排毒情況

整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組和攻毒組雞群均未出現(xiàn)明顯癥狀，且攻毒組蛋殼、蛋黃、蛋清質(zhì)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖6,7)。

1,2號(hào).為對(duì)照組雞蛋;3～5號(hào).為攻毒組圖6 對(duì)照組和攻毒組蛋殼質(zhì)量

01.為對(duì)照組;04.為攻毒組圖7 對(duì)照組和攻毒組蛋黃、蛋清質(zhì)量

3 結(jié)果

坦布蘇病自2010年暴發(fā)以來(lái)，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)特別是水禽業(yè)造成了重大損失，隨著疫苗的研究、開(kāi)發(fā)、應(yīng)用，在蛋鴨、種鴨方面取得明顯防控效果，但對(duì)臨床以共濟(jì)失調(diào)、癱瘓、神經(jīng)癥狀為主要特征的商品群如肉鴨、肉鵝等仍有較大危害。隨著坦布蘇病毒易感宿主范圍的擴(kuò)大，近年來(lái)蛋雞群特別是肉種雞群感染坦布蘇病毒報(bào)道逐漸增多，對(duì)家禽的危害也逐漸凸顯[7-9]。

本研究首次從我國(guó)出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降的肉種雞中分離到坦布蘇病毒，通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，坦布蘇病毒能夠造成雞群明顯降蛋，證明坦布蘇病毒是造成本次肉種雞群產(chǎn)蛋下降的主因；通過(guò)測(cè)序分析可見(jiàn)肉種雞中分離到的坦布蘇病毒與泰國(guó)毒株親緣關(guān)系較近(97.0%～98.8%)，與我國(guó)水禽流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(86.2%～89.3%)；通過(guò)病原學(xué)與血清學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)，發(fā)病雞群坦布蘇病毒抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率顯著(6.67%～32.6%)，假定健康雞群與育成階段雞群坦布蘇病毒抗體個(gè)別出現(xiàn)轉(zhuǎn)陽(yáng)情況(0～6.6%)，但并沒(méi)有病原陽(yáng)性檢出，仍需通過(guò)大量流調(diào)數(shù)據(jù)佐證，同時(shí)確定血液循環(huán)抗體對(duì)開(kāi)產(chǎn)后雞群的保護(hù)率；通過(guò)臨床病原學(xué)檢測(cè)并結(jié)合SPF蛋雞攻毒試驗(yàn)排毒規(guī)律可見(jiàn)，消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)坦布蘇病毒檢出率相對(duì)偏高，帶毒時(shí)間為7～10 d，同時(shí)結(jié)果也顯示攻毒14 d后剖檢雞只未檢測(cè)到坦布蘇病毒陽(yáng)性且雞群不再排毒，但產(chǎn)蛋率未恢復(fù)，故坦布蘇病毒感染雞群后是間歇性排毒還是一過(guò)性排毒，仍需進(jìn)一步探討研究。

坦布蘇病毒為黃病毒科黃病毒屬成員，多以節(jié)肢動(dòng)物(如蚊和脾等)為傳播媒介[10]，由于易感品種的寬泛，新型坦布蘇病毒在不同家禽品系中抗體陽(yáng)性率、臨床表癥相關(guān)性、帶毒排毒率、臨床危害程度等仍需通過(guò)相關(guān)流調(diào)工作進(jìn)一步研究以確定感染規(guī)律，密切關(guān)注坦布蘇病毒的跨種感染規(guī)律也具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。隨著坦布蘇病毒危害性加大，加強(qiáng)對(duì)不同易感宿主坦布蘇病毒的分離鑒定及其遺傳變異等研究對(duì)于該病的監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。