檢測豬圓環病毒4型實時熒光PCR方法的建立及應用

張 倩，王金鳳，劉立兵，付 琦，袁萬哲，趙 款，馬宏偉，馬增軍，王建昌*，韓慶安*

(1.河北省動物疫病預防控制中心，河北 石家莊 050035；2.河北科技師范學院 動物科技學院，河北 秦皇島 066004；3.石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050051；4.河北農業大學 動物醫學學院，河北 保定 071001)

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)為無囊膜單股負鏈環狀 DNA 病毒，屬于圓環病毒科(circoviridae)、圓環病毒屬(circovirus)，是目前發現最小的在哺乳動物體內復制的DNA病毒之一[1-2]。目前已報道的豬圓環病毒有4種：豬圓環病毒1型(porcine circovirus 1，PCV1)于1974年被首次發現并被證實對豬無致病性[3-4]；豬圓環病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)于1998年首次報道，目前已成為與多種豬臨床疫病綜合征相關的最重要病原之一[5-6]；豬圓環病毒3型(porcine circovirus 3，PCV3)是2016年從美國患病豬中首次鑒定出的一種新型豬圓環病毒[7-8]，目前已通過細胞培養成功分離[9]，但致病性還有待進一步研究[10-11]；豬圓環病毒4型(porcine circovirus 4，PCV4)是2019年在我國湖南省患有嚴重臨床疾病(包括呼吸道疾病、腹瀉和豬皮炎與腎病綜合征)的豬群中首次發現的一種新型PCV，與PCV1～3型具有顯著的遺傳差異[12]。豬圓環病毒4型(PCV4)的基因組大小約為 1 770 nt，包含12個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中ORF1和ORF2是兩個主要的開放閱讀框。ORF1大小為 891 nt，編碼296個氨基酸的復制酶蛋白(replicase protein，Rep)；ORF2大小為687 nt，編碼228個氨基酸的衣殼蛋白(capsid protein，Cap)[12]。

目前研究表明，PCV4在我國湖南、河南、山西、江蘇和廣西等地豬場中均存在不同程度的流行[12-16]。周繼勇等[12]對湖南省187份樣品的檢測結果顯示，PCV4陽性率高達12.8%，且在鼻拭子和血清樣品中陽性率最高。TIAN等[13]對河南省和山西省63份樣品的PCV4檢測陽性率為25.40%，在淋巴結、肺臟和腎臟中陽性檢出率較高，依次為66.67%,17.14%,15.38%。田潤博等[14]后續對河南省137份樣品的檢測結果表明，PCV4陽性率為13.87%； 在肺和脾臟中的檢出率最高，分別為21.43%和14.29%。陳南華等[15]對2016-2020年江蘇省的120份樣品進行了檢測，PCV4陽性率為3.33%。黃小武等[16]對廣西56份臨床樣品的PCV4檢測陽性率為 3.57%。但是在意大利和西班牙的300份豬樣品中未檢測到PCV4，目前在其他國家也未見PCV4感染的報道[17]。

目前對PCV4的檢測主要通過PCR或熒光PCR方法進行。本研究擬基于PCV4的ORF2基因，設計特異性引物和TaqMan探針，建立一種有效檢測豬臨床樣品中PCV4的實時熒光PCR方法，并對不同時期采集的868份河北省豬臨床樣品進行檢測，以期為PCV4相關疫病的早期診斷和分子流行病學調查提供技術支持，了解河北省豬群中PCV4的流行情況。

1 材料與方法

1.1 病毒、細菌和臨床樣品含有PCV4基因組全長序列的質粒(pUC57-PCV4質量濃度為25 mg/L)，根據GenBank中收錄的PCV4參考株序列(MK986820.1)由上海生工合成；PCV1、PCV2、PCV3、偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的基因組DNA和cDNA，大腸桿菌(E.coli)和沙門菌(Salmonella)基因組DNA，均由本實驗室于-80℃保存。

868份豬臨床樣品(扁桃體、淋巴結、脾臟、肺臟、腎臟)收集自2013—2020年間河北省10個不同地區的養殖場和屠宰場。

1.2 主要試劑與儀器病毒DNA(RNA)提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；2×GoTaq?Probe qPCR Master Mix、2×GoTaq?Green Master Mix，購自Promoga公司；T-Vector pMD-19(Simple)，購自寶生物工程(大連)有限公司；Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術有限公司。

高通量組織研磨儀(MM400)，德國RETSCH公司；NP968核酸自動提取儀，西安天隆科技有限公司；核酸蛋白測定儀(Nanodrop ND-2000)，美國Thermo公司；實時熒光PCR儀(StepOne Plus)，美國Thermo公司。

1.3 引物和探針的設計與合成根據GenBank已收錄的PCV4基因序列(登錄號：MK986820.1、MT015686.1、MT311854.1和MT769268.1)，經比對確定ORF2基因保守區域，利用Express3.0軟件設計1對特異性引物和1條TaqMan探針，預期擴增產物的大小分別為69 bp；利用Primer 5.0軟件設計1對能夠擴增包含ORF2基因全長的特異性引物，預期擴增產物的大小為708 bp。所有引物探針均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物和探針序列

1.4 核酸提取取50～100 mg組織病料，加入約1 000 mL PBS進行勻漿。充分勻漿后，12 000 r/min離心5 min，取上清，并按照病毒核酸提取試劑盒說明書，使用天隆全自動核酸提取儀進行自動提取。所提取病毒核酸于-20℃保存備用。

1.5 實時熒光PCR體系的優化以pUC57-PCV4為模板，采用矩陣法優化反應體系中引物和探針的濃度。反應體系為25 mL，其中2×Taq Probe qPCR Master Mix為12.5 mL，上下游引物(10 mmol/L)終濃度分別為0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L，探針(5 mmol/L)終濃度分別為0.1，0.2，0.3和0.4 mmol/L，模板2 mL，ddH2O補足至25 mL。反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環，在60℃時收集熒光。

1.6 特異性試驗以PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRRSV、PRV、PEDV、PPV、CSFV、E.coli和Salmonella基因組DNA或cDNA為模板，以ddH2O為空白對照，通過建立的實時熒光PCR方法進行檢測，以分析其特異性。

1.7 敏感性試驗按照公式：拷貝數(拷貝/mL)=6.02×1023×[質粒濃度(mg/L)×10-9/(質粒堿基數×660)]，計算pUC57-PCV4拷貝數為4.59×109拷貝/mL。將pUC57-PCV4作3倍稀釋后，進行10倍倍比稀釋，使之濃度范圍在1.53×100～1.53×107拷貝/mL之間。分別取1 mL 10倍系列倍比稀釋的pUC57-PCV4作為模板，以ddH2O作為空白對照，通過建立的實時熒光PCR方法進行檢測，以分析其敏感性。

1.8 實時熒光PCR方法標準曲線的建立取1 mL 10倍倍比稀釋的pUC57-PCV4(1.53×103～1.53×107拷貝/mL)作為模板，每個濃度設3個平行，通過所建立的實時熒光PCR方法進行檢測，利用熒光PCR儀所帶隨機軟件進行分析，繪制標準曲線。

1.9 重復性試驗選擇3個不同濃度(1.53×102,1.53×104,1.53×106拷貝/mL)的pUC57-PCV4為模板，進行實時熒光PCR擴增，分別進行3次組內和組間的重復性試驗。根據Ct值，通過統計學方法計算組內和組間變異系數(CV值)，以評估其重復性。

1.10 臨床樣品的檢測利用本研究建立的實時熒光PCR方法對實驗室保存的868份豬臨床樣品進行PCV4檢測，并選擇部分PCV4陽性樣品進行ORF2基因的擴增和分析。

1.11 ORF2基因全長擴增及測序選擇Ct值較小的3份PCV4陽性樣品，進行PCV4 ORF2全長擴增。PCR反應體系為25 mL：2×Taq PCR Master mix 12.5 mL，DNA模板5 mL，上、下游引物(25 mmol/L)各0.5 mL，dd H2O補足至25 mL；PCR反應條件：94℃ 5 min；95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 1 min，34個循環；72℃ 6 min，1個循環。對PCR產物純化回收后，連接pMD19-T載體，并將其轉化入E.coli感受態細胞中，37℃過夜培養后，挑取單個菌落進行搖菌，PCR鑒定為陽性的菌液由北京中科希林生物科技有限責任公司測序。將測序結果與國內已發表的PCV4 ORF2基因序列進行同源性分析。

2 結果

2.1 實時熒光PCR反應體系的優化經過對反應體系的優化，確定實時熒光PCR的最佳反應體系為：2×Taq Probe qPCR Master Mix 為12.5 mL，上下游引物(10 mmol/L)各1.5 mL，探針(5 mmol/L)為2 mL，模板1 mL，ddH2O補足至25 mL。

2.2 特異性試驗結果通過所建立的實時熒光PCR方法對PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRRSV、PRV、PEDV、PPV、CSFV、E.coli和Salmonella進行檢測，結果表明，僅PCV4出現特異性擴增，其他豬常見病原和空白對照均未出現明顯的熒光曲線，表明所建立方法有良好的特異性(圖1)。

1.PCV4;2.PCV1;3.PCV2;4.PCV3;5.PRV；6.PPV;7.PRRSV;8.CSFV;9.PEDV;10.E.coli;11.Salmonella;12.ddH2O圖1 PCV4實時熒光PCR方法的特異性試驗結果

2.3 敏感性試驗結果取1 mL 10倍系列稀釋的pUC57-PCV4作為模板，通過實時熒光PCR進行檢測。結果顯示，當質粒濃度為1.53×101拷貝/mL時，能夠出現特異性擴增曲線；當質粒濃度小于1.53×101拷貝/mL，沒有出現特異性擴增曲線(圖2)。因此確定該方法的最低檢出限為1.53×101拷貝/mL反應。

2.4 標準曲線的建立以系列稀釋的質粒作為模板，利用所建立的實時熒光PCR進行檢測，得到擴增標準曲線(圖3)。結果表明，模板濃度在1.53×107～1.53×103拷貝/L內與Ct值呈現良好的線性關系，線性回歸方程為y=-3.27x+39.927，其相關系數(R2)為0.999，擴增效率為102%，說明標準曲線的線性度好，可信度高。

圖3 PCV4實時熒光PCR方法標準曲線

2.5 重復性試驗結果以3個不同濃度的質粒作為模板，每個濃度設3個平行，進行實時熒光PCR檢測。結果表明，組內變異系數在0.31%～0.90%之間，組間變異系數在0.63%～1.05%之間，變異系數小于2%，表明所建立的熒光定量PCR方法的重復性好，穩定性高(表2)。

1.1.53×107 拷貝/L；2.1.53×106 拷貝/L；3.1.53×105 拷貝/L；4.1.53×104 拷貝/L；5.1.53×103 拷貝/L；6.1.53×102 拷貝/L；7.1.53×101 拷貝/L；8.1.53×100 拷貝/L；9.ddH2O圖2 PCV4實時熒光PCR方法的靈敏性試驗結果

表2 實時熒光PCR方法組內和組間重復性試驗結果

2.6 臨床樣品檢測結果通過所建立的實時熒光PCR方法對2013—2020年收集的868份臨床組織樣品進行PCV4檢測。結果顯示，11份樣品PCV4核酸陽性，陽性率為1.27%(11/868)。進一步分析表明，11份陽性樣品中8份為淋巴結，并且均收集自2019年(表3)。

表3 2013—2020年臨床樣品PCV4檢測結果 份

2.7 ORF2基因測序結果選取3份PCV4陽性樣品(Ct值分別為26.31，17.54，30.24)，進行病毒ORF2基因擴增及測序，獲得3條ORF2基因序列，分別命名為Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019和Hebei-LS1-2019，并上傳至GenBank(登錄號分別為MW439193、MT995847、MW439192)。

進一步運用DNAStar軟件中的MegAlign功能進行分析，結果表明Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019之間的核苷酸同源性為100%，同Hebei-LS1-2019之間的核苷酸同源性為99.1%。河北分離株同其他省份分離株ORF2基因同源性在98.4%～99.6%之間(圖4)。Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019同廣西分離株(PCV4/GX2020/NN88)、江蘇分離株(JSYZ1901-2)和安徽分離株(AHbz/2018)同源性最高，為99.6%；同湖南分離株(HNU-AHG1-2019、HNU-AHZ-2019)同源性最低，為98.7%。Hebei-LS1-2019同廣西分離株(PCV4/GX2020/NN88)、江蘇分離株(JSYZ1901-2)同源性最高，為99.6%；同湖南分離株(HNU-AHG1-2019、HNU-AHZ-2019)、河南分離株(Henan-LY1-2019)同源性最低，為98.4%。

圖4 PCV4河北分離株與國內分離株 ORF2序列的同源性比對

3 討論

自2019年PCV4在豬群中被首次發現以來，引起了世界范圍內的廣泛關注。快速有效的檢測方法對于了解PCV4在豬群中的流行情況，指導開展后續預防工作具有重要意義。目前已經建立了基于ORF1、ORF1-ORF2基因的PCV4實時熒光PCR方法[12-13,15-16]；基于ORF2基因的普通PCR方法[14]，并在不同地區豬群PCV4監測中發揮了重要作用。普通PCR方法需要瓊脂糖凝膠電泳，無法實現快速檢測。目前尚未見特異性檢測PCV4 ORF2基因保守序列的TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法的報道。

Cap蛋白為PCV4的主要結構蛋白，構成病毒的核衣殼，由ORF2基因編碼。通過對目前GenBank中收錄的PCV4序列進行比對，結果表明ORF2基因在PCV4中高度保守。本研究基于PCV4 ORF2基因保守序列，設計特異性引物和TaqMan探針，建立了特異性強、靈敏性高、重復性好的實時熒光PCR方法。本研究使用含有PCV4基因組全長序列的人工合成質粒作為模板，所建立方法在1.53×103～1.53×107拷貝/L的質粒濃度范圍內呈良好的線性關系，R2值達到0.999，僅對PCV4呈現特異性擴增；組內、組間變異系數均小于2%。本研究建立的PCV4實時熒光PCR檢測方法的最低檢出限為1.53×101拷貝/L反應，同陳南華等[15]建立的四重實時熒光PCR方法中對PCV4的檢測限(2.8×101拷貝/L)相近，明顯低于黃小武等[16]針對PCV4 Rep基因建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR方法的檢測下限(5.64×102拷貝/L)。相較于田潤博等[14]建立的PCV4普通 PCR方法，本研究檢測方法的靈敏性較其更高，且無需進行PCR產物的后續凝膠電泳，耗時更短，有效避免了“假陽性”結果的出現。

本研究涉及樣品數量多，共計868份；樣品來源廣，來自河北省10個不同地市；時間跨度大，涵蓋了2013—2020年樣品。檢測結果表明，近年來河北省豬群中存在PCV4的感染，但是感染率較低并局限于2019年樣品。河北省PCV4的陽性檢出率為1.27%(11/868)，與江蘇省和廣西省的PCV4檢出率較為接近(3.33%，3.57%)[15-16]，明顯低于湖南省和河南省的PCV4檢出率(12.8%，13.87%)[12，14]。進一步分析表明，本研究中豬淋巴結樣品的PCV4檢出率最高(8/11)，與TIAN等[13]對我國河南省和山西省63份臨床樣品的檢測的結果較為一致。進一步對3株河北分離株的ORF2基因測序分析表明，河北省不同豬群內PCV4之間存在一定的核苷酸差異，但是所有分離株均同廣西、江蘇分離株同源性最高(99.6%)，同湖南分離株同源性最低(98.4%，98.7%)。

目前在我國湖南、河南、江蘇、山西、河北等省份豬群中均有不同程度的PCV4檢出，但在國外未見相關報道[17]，表明PCV4可能在我國豬群中存在不同水平的流行和傳播。本研究建立的PCV4 實時熒光PCR檢測方法，為PCV4的快速檢測及流行病學調查提供了技術支持，對于了解PCV4在我國豬群中的流行情況，從而進一步了解PCV4對豬的致病作用具有重要意義。