塞尼卡病毒VP1蛋白亞單位候選疫苗小鼠免疫評價

孟 媛，曾嘉慶，于成東，張金勇，李 凱，高 旭，魯會軍*，金寧一*

(1.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122)

塞尼卡病毒(Seneca Valley virus，SVV)是一種具有二十面體結構、直徑27～30 nm的單鏈正鏈無囊膜RNA病毒，屬于小RNA病毒科塞尼卡病毒屬的唯一成員[1]。VP1是小RNA病毒具有最強免疫原性的結構蛋白，能夠與宿主細胞結合產生特異性免疫應答[2-3]。

自2008年以來，塞尼卡病毒病相繼報道于加拿大、美國等國家，發病豬臨床上呈現口鼻、蹄冠部和黏膜處潰瘍、糜爛，厭食、嗜睡、發熱和嘔吐等癥狀[4-5]。病毒主要感染育肥豬和新生仔豬，其中新生仔豬的死亡率高達30.0%～70.0%，發病周期持續1～2周[6]。該病在我國于2015年首先在廣東省確診，分離株與國外病毒株的同源性為94.4%～97.1%[7]。此后該病在河南、山東、黑龍江等多省發生[8-10]。當前，SVV疫苗的研究主要集中在油佐劑滅活疫苗和減毒活疫苗，防控本病仍無商品化疫苗可用。SVV滅活疫苗具有良好的免疫效果，但疫苗生產過程中病毒滅活不徹底會引起生物安全問題。同時，減毒活疫苗也有毒力返祖的危險。此外，我國豬群缺乏對SVV的免疫屏障，大量的亞臨床感染及無商品疫苗可用，增加了我國對該病的防控及凈化難度。因此，迫切需要開發一種具有高安全性的SVV新型疫苗。

佐劑是一種能增強抗原特異性免疫應答的物質。佐劑與抗原結合后，可誘導較強的免疫應答。佐劑有許多潛在的好處，例如減少疫苗接種的頻率和疫苗中使用的抗原的劑量，改善免疫應答，在某些情況下，提高成品疫苗的穩定性。

本研究在已制備的SVV VP1重組蛋白的基礎上[11-12]，聯合2種佐劑進行了小鼠免疫試驗，對其誘導BALB/c小鼠產生體液免疫和細胞免疫反應的能力進行了評價，探討了其作為SVV疫苗候選株的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞、蛋白、毒株及試驗動物原核表達的SVV VP1重組蛋白由本實驗室制備并保存；Trans1-T1和E.coliBL21(DE3) 化學感受態細胞購自北京全式金公司；pET-28a(+)載體，SVV毒株及BHK-21-21細胞由本實驗室保存。6周齡BALB/c小鼠購自斯貝福公司。

1.2 主要試劑尿素購自生工生物有限公司；His標簽Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質純化柱購于北京全式金公司；BCA蛋白定量試劑盒、山羊抗小鼠(HRP)標記IgG購自碧云天生物技術公司；弗式佐劑購自SIGMA公司；鋁鹽佐劑購自Invitrogen公司；TMB(ELISA)與終止顯色液購自Solarbio公司；紅細胞裂解液購自Beyotime公司；小鼠淋巴細胞分離液購自達科為公司； Mouse IFNg uncoated ELSA Kit、Mouse IL-4 uncoated ELISA Kit、Mouse IL-2 uncoated ELISA Kit均購自Thermo Fisher。

1.3 重組蛋白的純化及定量將重組菌接種到LB培養基中，總體積2 L。37℃、200 r/min培養至D600值為0.4～0.6。收集菌液使用Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質純化柱進行純化蛋白，進行SDS-PAGE分析。使用BCA方法確定純化后蛋白含量。

1.4 小鼠免疫試驗小鼠30只，隨機分為VP1-AL組、VP1-FCA組和PBS對照組3組，每組10只，免疫方案見表1。用VP1質量濃度為0.56 g/L的可溶性蛋白，聯合氫氧化鋁佐劑與弗式佐劑進行小鼠免疫，試驗組免疫抗原劑量50 μg/只，進行腿部肌肉注射100 μL/只，首免后14 d進行二免。

表1 小鼠免疫試驗

1.5 免疫效果評估

1.5.1特異性抗體 采用ELISA方法檢測免疫后VP1特異性抗體，包被VP1蛋白5.7 mg/L，經5%脫脂乳封閉后，加入血清(采集的血清10倍比稀釋，1∶20～1∶2×106)37℃孵育1 h；經PBST洗板后，加入HRP標記的山羊抗小鼠(1∶10 000)37℃孵育30 min；使用PBST洗板，加入TMB顯色液常溫避光作用15 min后，加入ELISA終止液。酶標儀測定 450 nm 處的D值，并根據P/N值計算其特異性抗體效價。

1.5.2中和抗體 將血清56℃滅活 30 min，以二倍倍比稀釋至 1∶2 048，并加入100 TCID50的病毒抗原，每孔50 μL，在37%孵育30 min。調整BHK-21細胞濃度為 5×105個/mL，以100 μL/孔接種至96孔培養板培養，觀察3 d，記錄病變孔。使用Reed-Muench法計算中和抗體效價。

1.5.3小鼠淋巴細胞的分離 每組隨機取3只小鼠，斷頸處死后浸泡于75%的乙醇中 15 min，于超凈臺中研磨分離小鼠脾臟細胞，計數備用。

1.5.4T淋巴細胞亞群檢測 取分離得到的淋巴細胞 1×106個于1.5 mL EP 管中，按說明書分別加入PE/Cy5anti-mouse CD3ε、FITC anti-mouse CD4、anti-mouse CD8a，而后加100 μL熒光洗液將細胞均勻混懸，于4℃避光孵育30 min，離心后使用PBS重懸，向 EP 管中加入200 μL熒光固定液，均勻混懸后轉移至流式管，于流式細胞儀檢測 CD3+CD4+與 CD3+CD8+細胞數。

1.5.5淋巴細胞增殖 取分離得到的淋巴細胞加至96孔細胞培養板中，每孔50 μL(細胞數為1×105個)，向細胞中分別加入50 μL的RPMI-1640、50 μL 的ConA(5 mg/L)以及50 μL SVV病毒(MOI=1)，分別作為對照組、非特異性刺激組以及特異性刺激組，每個樣品做3個重復。將96孔板置于CO2恒溫培養箱中于37℃下繼續培養72 h，而后每孔加10 μL(5 mg/L)WST-1 溶液，繼續培養4 h，使用酶標儀檢測其450 nm 的D值。

計算刺激指數(SI)，公式：SI=(刺激孔D450值-空白對照孔D450值)/(對照孔D450值-空白對照孔D450值)。

1.5.6細胞因子檢測 采集小鼠免疫后14，28，49 d 的血清100 μL，參照Mouse IFNg uncoated ELISA Kit、Mouse IL-4 uncoated ELISA Kit、Mouse IL-2 uncoated ELISA Kit說明書進行細胞因子的檢測。

1.5.7數據的統計分析 本研究采用 GraphPad Prism 軟件進行數據分析及繪制圖表。當P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 重組蛋白純化及定量結果VP1重組蛋白經Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質純化柱純化，透析前后的純化VP1蛋白SDS-PAGE結果見圖1，重組蛋白相對分子質量約為3.5×104。經BCA蛋白定量檢測法可得蛋白含量為2.4 g/L。

M.蛋白分子質量標準;1.VP1純化前;2.VP1純化后圖1 透析后的純化VP1重組蛋白SDS-PAGE分析

2.2 特異性抗體的檢測結果檢測每組不同小鼠間血清中VP1蛋白特異性抗體，由圖2可知，VP1-FCA組與VP1-AL組抗體水平始終高于PBS組，一免后7 d 各試驗組均呈上升趨勢，試驗組抗體水平始終高于PBS組，二免后14 d，VP1-FCA組、VP1-AL組特異性抗體效價分別達到最高值1∶163 840，1∶5 120，PBS組特異性抗體效價是1∶8(P<0.01)。

圖2 免疫小鼠特異性抗體效價檢測

2.3 中和抗體的檢測結果檢測小鼠血清中和抗體，由圖3可知，VP1-FCA組與VP1-AL組抗體水平始終高于PBS組，一免后14 d各試驗組均呈上升趨勢，試驗組在二免后7 d時中和抗體效價極顯著高于PBS組(P<0.01)，VP1-FCA組達到最高值(1∶512)，PBS組的中和抗體效價是1∶12。在二免后14 d時VP1-AL組達到最高值(1∶1 024)，PBS組的中和抗體效價是1∶16(P<0.01)。

圖3 免疫小鼠中和抗體效價檢測

2.4 T淋巴細胞的亞群檢測分離二免后與三免后小鼠的脾淋巴細胞，并檢測 CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴細胞亞群的數量，對其結果進行分析。由圖4可知,二免后試驗組的CD3+CD4+細胞亞型與CD3+CD8+細胞亞型水平均高于PBS組。其中VP1-AL組CD3+CD4+T細胞的水平高于PBS組1.94倍(P<0.01)，VP1-FCA組CD3+CD4+T細胞的水平高于PBS組1.92倍(P<0.05)。由圖5可知，VP1-FCA組CD3+CD8+T細胞的水平高于PBS組1.49倍(P<0.05)，VP1-AL組CD3+CD8+T細胞的水平高于PBS組1.40倍(P<0.01)。二免后試驗組的CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群升高。由此可知亞單位疫苗可誘導體液免疫和細胞免疫，選擇合適的佐劑可提高亞單位疫苗的免疫原性。

*表示與PBS組相比較差異顯著P<0.05；**表示與PBS組相比較差異極顯著P<0.01。下同圖4 35 d小鼠免疫CD3+CD4+T淋巴細胞亞群

圖5 35 d小鼠免疫CD3+CD8+T淋巴細胞亞群

2.5 淋巴細胞增殖試驗二免后處死小鼠并取其脾臟，分離淋巴細胞，進行淋巴細胞增殖試驗。由圖6可知，二免后VP1-FCA組與VP1-AL組的SI值均約是PBS組1.4倍(P<0.05)。試驗結果表明：SVV VP1亞單位疫苗可提高小鼠細胞免疫應答水平，并且在加強免疫后，使用氫氧化鋁佐劑的亞單位疫苗其免疫應答水平顯著提高。

圖6 淋巴細胞增殖試驗檢測結果

2.6 細胞因子的檢測結果

2.6.1細胞因子IL-4的檢測 結果見圖7。在小鼠一免后14 d時，試驗組IL-4細胞因子水平均高于PBS對照組，其中VP1-AL組是PBS 組的1.5倍(P<0.05)，VP1-FCA組是 PBS 組的2.9倍(P<0.01)。二免后21 d時VP1-AL組較一免后14 d升高47%，是PBS 組的2.2倍(P<0.05)。VP1-FCA組較一免后14 d降低34%，是 PBS 組的3.0倍(P<0.01)。結果顯示，VP1-AL組與VP1-FCA組能夠刺激小鼠Th2類細胞因子的分泌，從而提高體液免疫水平。

圖7 IL-4的檢測結果

2.6.2細胞因子IL-2的檢測 結果見圖8。在小鼠首免后14 d時，試驗組與PBS組差異不顯著(P>0.05)。在二免后21 d時，VP1-AL組與首免后14 d相比有所升高，是PBS組的1.8倍(P<0.01)；VP1-FCA組與首免后14 d相比變化不明顯，表明VP1-FCA組IL-2水平上升不明顯。

圖8 IL-2的檢測結果

2.6.3細胞因子IFN-γ的檢測結果 IFN-γ檢測結果見圖9，在小鼠一免后14 d時，VP1-AL組是PBS組的4.8倍(P<0.01)，VP1-FCA組是PBS組的3.5倍(P<0.01)。在二免后21 d時，各組差異不顯著(P>0.05)。綜合表明：試驗組能夠刺激小鼠 Th1 類細胞因子的分泌，從而提高細胞免疫水平。

圖9 IFN-γ的檢測結果

3 討論

近年來，塞尼卡病毒病正從國內豬新發傳染病到常見病過渡，在多省出現疫情，呈擴大趨勢，而且病毒有基因重組的風險，引起的毒株復雜多變，使得SVV可能會對我國的養豬業造成巨大的經濟損失。由于SVV尚未被列為必須檢測的豬傳染病，因此國內外貿易可能會加劇SVV在不同國家與地區的傳播[13]。同時，已從小鼠、小鼠糞便、蒼蠅及環境樣品中檢測出SVV，這表明SVV具有較高的傳染風險[14]。

由于亞單位疫苗是將免疫原注入到體內，引起動物機體的免疫應答，且亞單位疫苗的安全性好、不良反應低，可用于不宜使用活毒疫苗的情況，如妊娠母豬。而滅活疫苗免疫所需劑量大，次數多，成本較高；滅活過程中可能損害抗原表位導致免疫效果降低；并且研制滅活疫苗的重要前提是選取高病毒滴度的種子毒，以提高該疫苗誘導的體液免疫水平。YANG等[15]研制出首例SVV疫苗，使用的油佐劑滅活疫苗所需的抗原劑量較大，且當劑量減少時未能完全保護。此外，該滅活苗的中和抗體效價相對較低，最高只達到了1∶128。減毒活疫苗雖然免疫效果較滅活疫苗較為理想，但是疫苗毒遺傳性狀的穩定及安全性使其大規模生產傳代受到限制。SHARMA等[16]開發了SVV減毒活疫苗，雖然免疫效果良好，但是在免疫后出現了病毒血癥，并在分泌物中檢測出核酸陽性。李帥等[17]進行了對口蹄疫疫苗的穩定、免疫活性與顆粒佐劑的研究，采用首免后14 d進行二免，激發機體產生了較強免疫力，因此本研究采用相似免疫時間點進行探究。此外，鑒于口蹄疫病毒(FMDV)與SVV同屬于小RNA病毒科，且FMDV的疫苗研究較為豐富且成功，這為SVV候選疫苗研發指明了方向，如重組腺病毒載體疫苗、以納米材料為佐劑的新型病毒樣顆粒疫苗及多肽疫苗等[18-20]。

大腸桿菌載體是常用于重組蛋白表達的宿主菌，其具有培養簡單、成本低廉可快速大量生產的特點。本研究旨在制備SVV亞單位疫苗，利用純化的VP1蛋白聯合弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑免疫小鼠進行評價，并從特異性抗體、中和抗體、T 淋巴細胞增殖、T 淋巴細胞亞群、細胞因子 (IL-2、 IL-4、IFN-γ)進行免疫評估。結果表明，特異性抗體加強免疫后抗體水平顯著增加，二免后14 d達到最高(1∶163 840)，試驗組顯著高于PBS組(P<0.05)，各疫苗佐劑組間差異不明顯(P>0.05)。中和抗體檢測顯示試驗組抗體水平始終高于PBS組，初免后2周各試驗組均呈上升趨勢，試驗組在二免后7，14 d時中和抗體效價顯著高于PBS組(P<0.05)。細胞亞群水平檢測表明佐劑能夠促進CD4+T、CD8+T分化為Th1、Th2細胞，其中VP1-AL組免疫效果較好；淋巴細胞增殖試驗顯示各佐劑特異性刺激組SI值均高于PBS組(P<0.05)，且VP1-AL組SI值最高；檢測細胞因子IL-4的結果表明，VP1-AL組與VP1-FCA組均能夠刺激小鼠Th2 類細胞因子的分泌，從而提高體液免疫水平。檢測細胞因子IL-2與IFN-γ的結果表明，VP1-AL組與VP1-FCA組能夠刺激小鼠 Th1 類細胞因子的分泌，從而提高細胞免疫水平。鑒于，全世界豬群中只存在1種SVV血清型[21]，而且鋁鹽佐劑與弗式佐劑VP1亞單位疫苗免疫小鼠能夠誘導機體產生細胞免疫及體液免疫，因此VP1-AL組與VP1-FCA組候選疫苗可能成為預防與控制SVV傳播的有力工具。