HPLC-DAD法同時測定滋陰清熱降糖丸中9種成分

郭華榮，顧崇梅

(酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 酒泉 735000)

滋陰清熱降糖丸由沙參、麥冬、地黃等8味藥材組成，是由《景岳全書》所載玉女煎結(jié)合糖尿病特點(diǎn)和多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)組方而成，適用于陰虛熱盛型消渴病(Ⅱ型糖尿病)，方中以北沙參、麥冬為君，養(yǎng)陰生津止渴；以地黃、知母、黃連、大黃為臣，清熱涼血，滋陰降火；佐以蒼術(shù)、僵蠶，燥濕化痰，諸藥合用，共奏滋陰清熱之功，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，麥冬、地黃、知母、黃連、大黃有明顯降糖作用[1-5]，印證了本方功效。該制劑于2004年申請取得質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)文號(甘藥制字Z04090939)，但其檢驗(yàn)項(xiàng)目僅為顯微鑒別和梓醇TLC鑒別，未對處方中主要成分進(jìn)行定量分析，近年來也未對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作進(jìn)一步研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法同時測定滋陰清熱降糖丸中大黃所含大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚[6]，麥冬所含魯斯可皂苷元[7]，知母所含芒果苷[8]，地黃所含毛蕊花糖苷[9]，蒼術(shù)所含蒼術(shù)素[10]的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(配置DAD檢測器)購自美國安捷倫公司；XPE205DR電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DK-98-11A恒溫水浴鍋購自天津秦斯特儀器有限公司。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素(批號110795-201710，純度98.3%)、大黃酸(批號110757-201607，純度99.3%)、大黃素(批號110756-201913，純度96.0%)、大黃酚(批號110796-201922，純度99.4%)、大黃素甲醚(批號110758-201817)、毛蕊花糖苷(批號111530-201713)、蒼術(shù)素(批號111924-201806，純度99.5%)、魯斯可皂苷元(批號111909-201906，純度98.0%)、芒果苷(批號111607-201704，純度98.1%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。滋陰清熱降糖丸源于酒泉市中醫(yī)院(批號20190603、20190911、20191205、20200509、20200806、20201225)，相關(guān)陰性樣品為自制。分析純磷酸購自天津市化學(xué)試劑廠；分析純甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純甲醇、乙腈購自德國默克公司；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A)-甲醇(B)-0.1%磷酸(C)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；DAD檢測器，檢測波長0～12 min 280 nm(芒果苷)，12～17 min 340 nm(毛蕊花糖苷)，17～35 min 280 nm(魯斯可皂苷元)，35～71 min 254 nm(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)，71～95 min 340 nm(蒼術(shù)素)；進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取芒果苷、毛蕊花糖苷、魯斯可皂苷元、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為452.4、1 103.8、464.4、490.5、412.8、1 060.4、391.5、484.6、1 002.1 μg/mL的貯備液，精密量取適量，再分別進(jìn)一步稀釋至45.24、110.38、46.44、49.05、41.28、106.04、39.15、48.46、100.21 μg/mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 取丸劑適量研細(xì)，精密稱取細(xì)粉10 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL甲醇，稱定質(zhì)量，浸泡30 min后回流提取1 h，冷卻至室溫后甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 取缺麥冬、缺地黃、缺大黃、缺知母、缺蒼術(shù)的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品在與對照品相同保留時間處有色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

1.芒果苷 2.毛蕊花糖苷 3.魯斯可皂苷元 4.蘆薈大黃素 5.大黃酸 6.大黃素 7.大黃酚 8.大黃素甲醚 9.蒼術(shù)素1.mangiferin 2.verbascoside 3.ruscogenin 4.aloeemodin 5.rhein 6.emodin 7.chrysophanic 8.physcion 9.atractylodin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，甲醇稀釋至20 mL量瓶中，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得芒果苷、毛蕊花糖苷、魯斯可皂苷元、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素峰面積RSD分別為1.89%、2.35%、1.77%、2.49%、2.78%、2.51%、2.23%、1.85%、1.89%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑(批號20200806)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芒果苷、毛蕊花糖苷、魯斯可皂苷元、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素峰面積RSD分別為1.54%、2.09%、1.87%、2.38%、2.64%、2.33%、2.47%、2.01%、1.80%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，于0、2、4、8、16、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芒果苷、毛蕊花糖苷、魯斯可皂苷元、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素峰面積RSD分別為1.95%、2.36%、1.81%、2.19%、2.72%、2.44%、2.30%、1.75%、1.41%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批丸劑(批號20200806)6份，每份5 g，精密加入對照品溶液(芒果苷、毛蕊花糖苷、魯斯可皂苷元、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蒼術(shù)素質(zhì)量濃度分別為3.753 0、0.150 5、1.507 8、0.068 0、0.103 0、0.124 0、0.151 0、0.070 0、2.310 0 mg/mL)1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，9種成分平均加樣回收率(RSD)分別為芒果苷96.74%(1.81%)、毛蕊花糖苷100.91%(2.23%)、魯斯可皂苷元98.85%(1.65%)、蘆薈大黃素97.13%(2.40%)、大黃酸96.42%(2.80%)、大黃素100.34%(2.18%)、大黃酚97.20%(2.51%)、大黃素甲醚(2.48%)、蒼術(shù)素95.86(2.08%)。

2.4 樣品含量測定 取6批丸劑(批號20190603、20190911、20191205、20200509、20200806、20201225)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果 (mg/g)Tab.3 Results of content determination of various constituents (mg/g)

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測器對供試品溶液進(jìn)行190～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在254 nm處吸收良好，色譜峰對稱性理想；魯斯可皂苷元、芒果苷在280 nm處有最大吸收，色譜峰響應(yīng)值比較大；毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素在340 nm處有最大吸收，故選擇254、280、340 nm作為檢測波長。

3.2 流動相篩選 本實(shí)驗(yàn)以乙腈-磷酸[11-12]、甲醇-磷酸[13-15]、甲醇-醋酸[16]、乙腈-醋酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)均能將蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分離，但其他成分分離效果不佳。最終，選用甲醇-乙腈-0.1%磷酸[17]，能將9種成分全部分離，而且效果較理想。

3.3 柱溫篩選 本實(shí)驗(yàn)采用同一色譜儀和色譜柱，比較了25、30、35、40 ℃下9種成分色譜峰的分離效果，發(fā)現(xiàn)無明顯差異。綜合考慮保留時間、色譜柱耐用性、室溫，最終選擇柱溫為30 ℃。

3.4 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取方法(超聲法、加熱回流法)，發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果最佳，而且加熱回流法較超聲法提取完全。因此，選擇甲醇加熱回流提取作為供試品溶液制備方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法同時測定滋陰清熱降糖丸中大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、魯斯可皂苷元、芒果苷、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素的含量，該方法簡便可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。