艾柱揮發油和燃燒產物成分GC-MS分析及抗氧化活性比較

陳如一，史悅悅，張曉熙，趙鑫鈺，夏道宗

(浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

艾葉為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLévi.et Vant.的干燥葉，為2020年版《中國藥典》一部所收錄的中藥材。艾葉性溫，味辛、苦，歸肝、脾、腎經，具有溫經止血、散寒止痛、理氣安胎等功效[1]。艾柱是由艾葉加工的艾絨填充而成的柱狀物，常用于中醫藥養生保健。研究表明，艾柱含揮發油、黃酮、萜類及多糖等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[2-3]。艾灸療法是傳統針灸的重要組成部分，是一種由經絡調節、溫熱效應、燃燒產物的成分共同作用的綜合效應。艾柱的燃燒產物較為復雜，文獻報道其成分差異較大，除了與燃燒原材料有關外，還與燃燒裝置、測定方法等有關[4]。

氧化應激是機體或細胞內氧化/抗氧化平衡失調的病理狀態，在多種疾病的發生發展中起著重要作用[5]。目前有關艾葉抗氧化功能的文獻報道較多[6]，但關于其加工產品艾柱的研究很少。郭太虎等[7]研究發現艾灸可使D-半乳糖所致衰老大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)水平下降，提示艾灸具有較好的抗氧化效果。因此，本研究主要對艾柱揮發油和燃燒產物成分進行GC-MS分析，并通過自由基清除法和總抗氧化能力測定法比較其抗氧化活性，以期為深入分析艾柱及艾灸作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 7890-5977A型氣相色譜-質譜儀(美國Agilent公司)；Concentrator Plus真空濃縮儀、移液槍(德國Eppendorf公司)；HA120-50-01超臨界萃取裝置(中國南通華安公司)；Synergy H1酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；RE52CS-1旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ 循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；W201B 數控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術有限公司)；BSA224S-CW 電子天平[賽多利斯(北京)天平有限公司]；KQ-500DE型 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 艾柱(浙江乾一生物科技有限公司，批號20190415)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號20190906)；95%乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司，批號20181011)；抗壞血酸(廣東光華化學廠有限公司，批號20190811)；2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(批號STBG8547)、2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(批號BCBT2871)、2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt)(批號SLBL5589V)均購于美國Sigma公司；硫酸亞鐵七水合物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號D172003)；過硫酸鉀(宜興市第二化學試劑廠，批號170501)；三氯化鐵六水合物(上海泰坦科技股份有限公司，批號P1519028)；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 艾柱揮發油提取 采用超臨界二氧化碳萃取法。取艾柱150 g，置入CO2超臨界萃取釜中。萃取條件為萃取釜壓力21.5 MPa；溫度40 ℃；萃取時間120 min；分離釜Ⅰ壓力6.4 MPa，溫度45 ℃；分離釜Ⅱ壓力6.4 MPa，溫度35 ℃。首次萃取時，每0.5 h加入50 mL無水乙醇作為夾帶劑，循環萃取2次。得到的產品，離心除去蠟質沉淀，濾液于40 ℃減壓回收乙醇，得到脫蠟質艾柱揮發油。以40 mg/mL的質量濃度溶于無水乙醇中，超聲波振蕩溶解，加入適量無水硫酸鈉脫水2 h，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后，蒸發濃縮，得到艾柱揮發油[8]。計算得艾柱揮發油的平均得率為1.46%。

1.3.2 艾柱燃燒產物收集 取50 g艾柱于自制燃燒裝置的燃燒塔中，暗火燃燒，在吸收瓶中加入無水乙醇作為煙霧吸收溶劑，緩沖瓶與真空泵連接。調節循環水泵控制艾柱的燃燒速度，使燃燒產物能夠被充分吸收。將艾柱燃燒產物過濾，蒸餾濃縮后，離心取上清液，計算得艾柱燃燒產物的平均得率為1.01%。

1.3.3 艾柱揮發油GC-MS分析 氣相色譜條件為色譜柱Agilent HP-5MS (30 m × 250 μm，0.25 μm)；載氣高純氦氣，純度 ≥ 99.999%；進樣量3 μL；體積流量1 mL/min；分流比20∶1，進樣口溫度300 ℃；柱溫采用程序升溫(100 ℃保持10 min；8 ℃/min升溫至180 ℃；3 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；1 ℃/min升溫至235 ℃；10 ℃/min升溫至285 ℃；最后以1 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min)。質譜條件為EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃。全掃描模式為掃描范圍m/z40～500；質譜檢索標準庫NIST14.L標準譜庫。根據以上條件分析鑒定艾柱揮發油中的主要成分。

1.3.4 艾柱燃燒產物GC-MS分析 色譜柱、載氣同“1.3.3”項；進樣量1 μL；體積流量1 mL/min；分流比10∶1；進樣口溫度300 ℃；柱溫采用程序升溫(50 ℃保持10 min；4 ℃/min升溫至100 ℃，保持2.5 min；4 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min；5 ℃/min升溫至230 ℃；1 ℃/min升溫至235 ℃；10 ℃/min升溫至285 ℃，保持5 min；最后以1 ℃/min升溫至300 ℃，保持10 min)。質譜條件同“1.3.3”項。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 溶液制備 取適量艾柱揮發油、燃燒產物，分別制備成質量濃度為50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 μg/mL的樣品溶液，確保艾柱揮發油及燃燒產物樣品溶液在相同質量濃度下，艾柱原料的量相同。精密稱取Vc適量，制備成5、10、25、50、100、250、500、1 000 μg/mL的對照品溶液，均存放于低溫避光處，現用現配。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測定 吸取100 μL 0.2 mmol/L DPPH和100 μL不同質量濃度的樣品溶液于96孔板中，然后在室溫(避光)下孵育30 min,用95%乙醇做參比，在517 nm處測定吸光度值Ai。測定0.2 mmol/L DPPH溶液與等體積95%乙醇的混合液的吸光度Ac，以及待測液(樣品組)與等體積95%乙醇混合液的吸光度Aj[9]。重復3次，取平均值。按如下公式計算待測樣品的自由基清除率，清除率=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力測定 吸取180 μL ABTS分析溶液和20 μL不同質量濃度的樣品溶液于96孔板中，混勻后于暗處靜置10 min，用95%乙醇做參比；在734 nm處測得吸光度值。以20 μL 95%乙醇替代樣品溶液作為對照管，加180 μL ABTS分析溶液配置，測定吸光度值[9]。重復3次，取平均值。按如下公式計算待測樣品的自由基清除率，清除率=(1-樣品管A734/對照管A734)×100%。

1.3.5.4 總抗氧化能力測定 吸取6 μL系列濃度為400、600、800、1 000、2 000、5 000 μmol/L的FeSO4溶液，與180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸餾水，在酶標儀中37 ℃孵育4 min，于593 nm下讀取吸光值，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。吸取6 μL待測樣品，與180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸餾水，在37 ℃反應4 min，于593 nm波長下讀取吸光值(重復3次，取平均值)，并在標準曲線上獲得待測樣品相應的FeSO4濃度，定義為當量濃度(FRAP值)。結果表示為每mg樣品中相當于的FeSO4的量(mmol/L)[9]。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0以及Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析及作圖。

2 結果

2.1 艾柱揮發油中成分GC-MS分析 采用峰面積歸一化法確定艾柱揮發油中各個組分的相對含量，結合相關文獻以及NIST14.L標準譜庫，取匹配度在80以上的最高值對成分進行歸屬。艾柱揮發油GC-MS總離子流圖(TIC)見圖1，分析結果見表1。結果顯示，從艾柱揮發油中共鑒定出34種成分，主要為醇類、酚類、脂肪酸類、醛酮類、烯烴類。

圖1 艾柱揮發油總離子流圖

表1 艾柱揮發油成分分析結果

2.2 艾柱燃燒產物中成分GC-MS分析 艾柱燃燒產物中化學成分的分析鑒定方法同“2.1”項，其GC-MS總離子流圖見圖2，分析結果見表2。結果顯示，從艾柱燃燒產物中也鑒定出34種成分，主要為酚類、醇類、酯類、酮類、羧酸類、烷烴類。

表2 艾柱燃燒產物成分分析結果

圖2 艾柱燃燒產物總離子流圖(TIC)

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH自由基清除作用 如圖3所示，艾柱揮發油及燃燒產物均可抑制DPPH自由基的產生，其IC50值分別為1 127、85.6 μg/mL，陽性對照Vc的IC50值為4.21 μg/mL。結果表明，艾柱燃燒產物對DPPH自由基的清除能力明顯強于艾柱揮發油。

圖3 艾柱揮發油及燃燒產物對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+自由基清除作用 如圖4所示，艾柱揮發油及燃燒產物均可抑制ABTS+自由基的產生，其平均IC50值分別為327.2、81.9 μg/mL，陽性對照Vc的平均IC50值為45.7 μg/mL。表明，艾柱燃燒產物對于ABTS+自由基的清除能力顯著強于艾柱揮發油，與對照品Vc相當，顯示出極好的抗氧化活性。

圖4 艾柱揮發油及燃燒產物對ABTS+自由基的清除作用

2.3.3 總抗氧化能力測定 以FeSO4濃度為橫坐標(X)，吸光度值為縱坐標(A)，進行回歸，得回歸方程為A=3.322 3X-1.187 9(r=0.998 7)。經過測定，艾柱揮發油的總抗氧化能力(FRAP均值)為0.278 4 mmol/L FeSO4當量，艾柱燃燒產物的FRAP均值為0.802 mmol/L FeSO4當量，對照品Vc的FRAP均值為8.003 mmol/L FeSO4當量。結果表明，艾柱燃燒產物的總抗氧化能力要顯著優于艾柱揮發油，FRAP值約為后者的2.9倍。

3 討論

艾灸療法具有溫通經脈、運行氣血、回陽救逆、消毒散熱、祛瘀散結等作用，其療效的發揮與艾(柱)的藥理作用、燃燒產物及其類芳香療法作用等密切相關[10]。于密密等[11]采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法對艾燃燒生成物中的苯酚含量進行定量測定，指出即使在極端情況下診室內所產生的艾煙中的苯酚含量仍小于工業企業設計衛生標準(TJ36-79)規定的車間空氣中有害物質最高容許濃度，證實了艾灸療法的安全性。艾柱揮發油中含量最高的是以γ-谷甾醇(7.67%)為代表的醇類化合物，占總峰面積的19.73%，其他成分含量高低依次為酚類、脂肪酸類、醛酮類及烯烴類；其中一些化合物的生物活性已有報道，如γ-谷甾醇、α-生育酚、環氧石竹烯、龍腦、川陳皮素等具有抗氧化、抗炎抗菌、降脂、增強機體免疫力藥理作用[12-14]。

此外，本研究從艾柱燃燒產物中分析鑒定出34種化合物，但這些成分與艾柱揮發油有很大差異；所鑒定成分色譜峰面積之和占總峰面積的30.73%；其中含量最高的是以苯酚(3.01%)為代表的醇(酚)類化合物，占總峰面積的14.34%，其他成分含量高低依次為酯類、酮類、羧酸類及烷烴類；艾柱燃燒產物中苯酚、豆甾醇、羽扇烯酮等成分在抗氧化、消毒殺菌、抗炎鎮痛等方面具有重要作用[11,15]。

現已證明與自由基有關的疾病有上百種，進行體外實驗可以排除體內實驗的復雜性，從而能夠更為直接地觀察受試物的作用效果，為受試物的體內實驗提供科學依據[16-17]。本研究通過自由基清除(DPPH、ABTS+)和總抗氧化能力(FRAP法)測定比較艾柱揮發油和艾煙燃燒產物的體外抗氧化活性，結果表明艾柱燃燒產物的抗氧化活性均明顯強于艾柱揮發油。結合成分鑒定結果，α-生育酚是艾柱揮發油的重要組分，也可能是艾柱揮發油的主要抗氧化物質；此外，艾柱揮發油中具有較多的飽和及不飽和脂肪酸，但是烯烴類成分較少，這可能是其抗氧化活性弱于艾柱燃燒產物的重要原因。相反，在艾柱燃燒的過程中，產生了較多的苯酚、豆甾醇等活性物質，均具有較好的抗氧化活性。需要指出的是，本研究中所采用的體外抗氧化體系是水環境體系，在一定程度上限制了脂溶性物質抗氧化功能的發揮。另外，在以往對艾柱燃燒產物的研究中，多采用苯、正丁醇等有機溶劑進行吸收，具有一定的危害性[4,11]。本實驗采用乙醇作為艾柱燃燒產物的吸收溶劑，更加貼近臨床實際。

總之，本研究中艾柱揮發油和燃燒產物在成分組成上存在較大差異；在試驗濃度范圍內，艾柱燃燒產物的抗氧化活性明顯優于艾柱揮發油，結果表明艾柱燃燒后，產生了更多活性成分，以期為深入研究艾柱藥理作用機制和艾灸類芳香療法提供依據。