雌孕激素調節水通道蛋白9表達并通過細胞外調節蛋白激酶通路影響囊胚著床的研究*

劉 敏，陳登榜△，米永杰，代呂霞，代 娟，何 煦

1.成都醫學院 臨床醫學國家級實驗教學示范中心(成都 610500)；2.成都醫學院 檢驗醫學院(成都 610500)

著床是指囊胚通過與子宮內膜相互作用逐漸植入子宮內膜的動態過程。在胚胎著床時，胚胎滋養外胚層細胞表現出與惡性腫瘤細胞相似的侵襲行為，且比腫瘤細胞具有更強的侵襲力[1]。近年來，研究[2-5]發現，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)在惡性腫瘤細胞數量增加、細胞形態變化及細胞運動中均起到重要作用，而這些因素與腫瘤細胞的侵襲力密切相關。

AQPs是介導水轉運的6次跨膜蛋白，其廣泛存在于動物及植物中，在維持機體內環境的動態平衡中發揮重要的生理作用[6]。AQPs根據功能分為水通道蛋白和甘油水通道蛋白。該蛋白不僅可以介導自由水的跨細胞膜轉運，還可介導小分子物質如甘油的轉運[7]，AQP9屬于該亞族成員。Chen等[8]研究發現，前列腺癌細胞的AQP9可促進水和甘油的運輸，并調節癌細胞的增殖和遷移，當低表達前列腺癌細胞AQP9時，可抑制癌細胞遷移。因此，AQP9介導的水和甘油的轉運在細胞轉移和侵襲中發揮著關鍵作用。通過免疫熒光和原位雜交技術發現，AQP9在著床前的囊胚滋養外胚層細胞中表達豐富[9]，鑒于囊胚滋養外胚層細胞與腫瘤細胞生物學行為相似，均具有較強的侵襲性，故推測卵巢激素可調節囊胚AQP9表達，AQP9參與了囊胚對子宮內膜的粘附和侵襲，對胚胎的著床發揮了重要作用。本研究旨在探討卵巢雌孕激素對囊胚滋養外胚層細胞AQP9表達的調節，以及AQP9在囊胚對子宮內膜的粘附和著床中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠胚胎的獲取

所有實驗均使用7～9周齡美國癌癥研究所(institute of cancer research，ICR)小鼠，小鼠購于成都達碩實驗動物股份有限公司。小鼠胚胎的獲取按照以下方法[10 ]進行：雌性ICR小鼠經腹腔注入10 IU的孕馬血清促性腺激素(pregnant horse sera gonadotropin，PMSG)，48 h后注射10 IU的人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)。雄性和雌性小鼠按1∶2合籠，次日晨檢查雌性小鼠陰栓，以查見陰栓為孕第1天，在孕4 d上午處死小鼠，取出小鼠雙側子宮角，使用M2液沖洗宮腔獲得囊胚。本研究通過成都醫學院醫學倫理委員會批準，實驗操作符合關于善待實驗動物指導性的意見要求。

1.2 建立小鼠胚胎的體外著床模型

將子宮內膜上皮細胞株Ishikawa接種于24孔板中，培養24 h，待細胞貼壁后，將處理后的囊胚移入培養有Ishikawa上皮細胞的培養孔中，培養12 h后，將培養板置于倒置顯微鏡觀察囊胚的粘附情況。輕輕搖動培養板20 s，若囊胚沒發生位置改變則記為粘附囊胚，計算各組囊胚的粘附率。

1.3 siRNA干擾

按riboFectTMCP Transfection Kit(166T) 說明書進行轉染。用Buffer(v1)稀釋siRNA-AQP9(si-AQP9)儲存液，室溫放置5 min；加入riboFectTMCP Reagent，室溫孵育15 min；向含有囊胚的培養孔中加入si-AQP9與riboFectTMCP Reagent的復合物，使si-AQP9的終濃度為100 nmol/L。轉染24 h后，收集囊胚用于后續實驗。

1.4 RT-PCR 檢測囊胚細胞AQP9的mRNA表達

收集小鼠囊胚，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度計確定濃度，OD260與OD280比值在1.8～2.1，用于后續實驗。參照逆轉錄試劑盒說明書構建逆轉錄體系，反轉錄合成cDNA。熒光定量PCR儀上進行擴增反應，反應體系為：以 95 ℃、30 s, 95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，變性和退火進行了45個循環。采用MUS β-actin作為內參基因，利用SDS軟件進行數據分析樣本的Ct值，計算mRNA表達水平。利用Primer 6.0軟件設計合成引物序列：MUS AQP9上游引物：5′-CCC AGGCTCTTCACTGCTCT-3′, 下游引物：5′-GGG GTTCGAGTGATGCATTT-3′；β-actin上游引物：5′-TCAGGAGGAGCAATGATC TTG-3′,下游引物：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAG CTA-3′。

1.5 蛋白質印跡技術

采用蛋白質印跡技術檢測小鼠囊胚滋養外胚層細胞磷酸化細胞外調節蛋白激酶1和2(Phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2,p-ERK1/2)蛋白表達。在收集的囊胚樣品中加入RIPA裂解液，將收集的裂解液置于4 ℃、12 000 r/min、離心半徑6.215 cm、離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度；在樣品中加入5×Loding buffer，沸水變性15 min，隨后12 000 r/min、離心半徑6.215 cm、離心3 min，收集上清液備用；濃縮膠起始電壓100 V進行電泳15 min，分離膠180 V電泳，到達凝膠底部時終止電泳。采用“三明治”濕法，把凝膠上的蛋白條帶轉移至PVDF膜上，將PVDF膜置于37 ℃、用5%脫脂奶粉封閉2 h。PVDF膜采用一抗(p-ERK1/2 1∶1 000、β-actin 1∶5 000)在4 ℃過夜孵育，加入二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h；采用ECL化學發光試劑進行檢測，凝膠成像系統進行曝光。以產物蛋白條帶強度與內標強度的比值來反應檢測蛋白的表達水平。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 雌孕激素對囊胚細胞AQP9表達的調節

將收集的小鼠孕第4天的囊胚分為4個實驗組，分別為空白對照組(Ctrl組)，加入0.01 μmol/L雌二醇的E2組，加入1 μmol/L孕激素的P4組，以及加入0.01 μmol/L E2和1 μmol/L P4的E2+P4聯合處理組，在處理24 h后收集各組囊胚，采用 RT-PCR檢測結果發現，與Ctrl組相比較，E2+P4聯合處理組AQP9在囊胚細胞中的表達升高，且與E2組、P4組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明AQP9的表達受到E2+P4激素的聯合調節(圖1)。

圖1 雌孕激素對囊胚滋養外胚層細胞AQP9表達的調節

2.2 雌孕激素對囊胚粘附的影響

在體外培養的囊胚中加入E2+P4激素，以及小干擾si-AQP9 100 nmol/L低表達囊胚滋養外胚層細胞中AQP9，作用24 h后收集囊胚，將囊胚與子宮內膜上皮株Ishikawa聯合培養12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發現，與Ctrl組囊胚粘附率(73.33±12.28)%比較，si-AQP9干擾組囊胚的粘附率(33.33±5.17)%明顯下降(P<0.05)(圖2)。

圖2 囊胚在子宮內膜上皮細胞的粘附率

2.3 雌孕激素對囊胚細胞AQP9表達的影響

2.3.1 檢測囊胚AQP9 mRNA和p-ERK1/2表達 在培養的囊胚中，加入E2+P4激素以及小干擾si-AQP9 100 nmol/L低表達囊胚滋養外胚層細胞中AQP9，作用24 h后收集囊胚，采用RT-PCR檢測。結果顯示，與Ctrl組相比較，si-AQP9組囊胚滋養外胚層細胞中AQP9 mRNA表達下降(圖3A)。收集的囊胚采用蛋白質印跡技術檢測發現，si-AQP9組囊胚滋養外胚層細胞p-ERK1/2蛋白的表達也較Ctrl組明顯降低(圖3B)。

2.3.2 檢測囊胚AQP9 mRNA表達 在培養的囊胚中加入E2+P4激素及ERK1/2的抑制劑U0126 20 mmol/L，以抑制囊胚滋養外胚層細胞中ERK1/2活性，24 h后收集囊胚。RT-PCR結果顯示，U0126組囊胚滋養外胚層細胞中AQP9 mRNA表達與Ctrl組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3C)。

2.3.3 觀察囊胚在子宮內膜上皮細胞的粘附率 在培養的囊胚中加入E2+P4激素及ERK1/2的抑制劑U0126 20 mmol/L，以抑制囊胚滋養外胚層細胞中ERK1/2活性，24 h后收集囊胚，再將囊胚和子宮內膜上皮聯合培養12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發現，與Ctrl組囊胚的粘附率(76.92±9.01)%比較， U0126組粘附率(27.27±6.36)%明顯降低(圖3D)。

圖3 雌孕激素對囊胚細胞AQP9表達影響并通過ERK信號通路對囊胚粘附的影響

3 討論

AQP9為甘油水通道蛋白亞家族成員，可以介導自由水的跨細胞膜轉運，還可介導甘油的轉運，從而參與腫瘤的生成、侵襲和轉移[11-13]。研究[14]發現，卵巢雌激素可通過上調AQP9 mRNA，使輸卵管上皮AQP9蛋白的表達增加，表明AQP9的表達受到卵巢激素的調節。故推測卵巢激素調節了囊胚的AQP9表達。在體外培養的孕4 d的囊胚中，分別加入E2、P4以及E2+P4，結果發現E2+P4組囊胚細胞中的AQP9表達升高，這表明囊胚AQP9的表達受到E2+P4激素的聯合調節。

近年來，通過免疫熒光和原位雜交技術研究[9，15]發現，AQP9在著床前、小鼠孕4 d的囊胚滋養外胚層細胞中表達豐富，而囊胚滋養外胚層細胞比腫瘤細胞更具有侵襲性。因此，考慮AQP9是否參與了囊胚對子宮內膜上皮的粘附和侵襲，從而在早期胚胎的著床中起到了關鍵作用。為了驗證這一假設，將si-AQP9小干擾加入培養的孕鼠囊胚細胞中，低表達囊胚滋養外胚層細胞中AQP9，再將小干擾處理后囊胚與子宮內膜上皮細胞株Ishikawa細胞進行聯合培養12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發現，與Ctrl組囊胚粘附率相比較，si-AQP9干擾組囊胚在子宮內膜上皮細胞的粘附率下降，這提示囊胚AQP9參與了囊胚對子宮內膜上皮細胞的粘附。

進一步探討AQP9參與囊胚對子宮內膜上皮細胞粘附作用的機制。研究[8]發現，前列腺癌PC-3細胞的AQP9可促進ERK1/2的磷酸化，使ERK1/2被激活，從而介導前列腺癌細胞的遷移和侵襲。ERK是絲/蘇氨酸蛋白激酶，為MAPK家族成員之一，定位于胞漿；ERK磷酸化后被激活，轉位至胞核，調節轉錄因子活性，參與各類細胞的生長、發育以及分裂[16]。并且磷酸化后激活的ERK1/2還可以參與維持細胞形態、細胞增殖與分化以及腫瘤侵襲、轉移[11-13]。此外，在著床前早期，囊胚滋養外胚層細胞中也發現ERK的表達[15]，而囊胚滋養外胚層細胞與腫瘤細胞生物特性相似。因此，推測在胚胎著床前期，卵巢雌孕激素可上調早期囊胚細胞AQP9表達，并通過ERK通路參與了早期囊胚滋養外胚層細胞對子宮內膜細胞的粘附和侵襲。在培養的囊胚中，加入E2+P4激素以及si-AQP9低表達滋養外胚層細胞中AQP9，檢測了囊胚細胞中p-ERK1/2的表達情況，發現與Ctrl組比較，si-AQP9組的p-ERK1/2表達降低，這表明卵巢雌孕激素通過上調囊胚AQP9表達而激活ERK通路。而在培養的囊胚中，加入ERK1/2的抑制劑U0126，以抑制囊胚滋養外胚層細胞中ERK1/2活性，結果發現U0126組囊胚滋養外胚層細胞中AQP9 mRNA表達與Ctrl組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示囊胚AQP9為ERK1/2信號通路的上游分子。進一步在體外培養囊胚中雌、孕激素作用后，加入ERK1/2抑制劑U0126抑制囊胚滋養外胚層細胞中ERK1/2活性，再將囊胚和子宮內膜上皮聯合培養12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發現，U0126組囊胚在子宮內膜上皮細胞的粘附率降低，表明雌孕激素通過ERK通路影響囊胚粘附。

綜上所述，在胚胎著床前期，卵巢雌孕激素可上調胚胎細胞AQP9表達，并通過ERK通路參與早期囊胚滋養外胚層細胞對子宮內膜細胞的粘附和侵襲，在胚胎著床中發揮了重要作用。本研究從一個新的視角探討了影響囊胚粘附、侵入和著床的機制，為臨床上不孕癥的診斷提供新的生物學標志物，并為不孕癥的預防和治療提供一個新思路。