蘆丁對全氟辛酸造成的小鼠腦氧化損傷及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

劉芳芳，孫偉強(qiáng)，馬新壯，程靜靜，王 力，劉 輝△

1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院(蚌埠 233030)；2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院(蚌埠 233030)

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是一種全氟烷基酸，其碳鏈上的氫原子被氟原子取代，形成高能的碳氟鍵，在高溫下穩(wěn)定、不易燃、不揮發(fā)，不會被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或氧化劑降解[1]。目前PFOA廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，包括涂料、不粘廚具、表面潤滑劑、消防泡沫和紡織品等生產(chǎn)[2]。PFOA的廣泛使用引起了環(huán)境污染并在環(huán)境介質(zhì)中長期存在，并具有生物累積放大效應(yīng)，這使其成為一種持久性有機(jī)環(huán)境污染物，在環(huán)境中含量很高。人類接觸PFOA的主要來源是食物(如魚產(chǎn)品、飲用水)，以及吸入的粉塵和消費(fèi)品(如家具、地毯、清潔劑、不粘炊具等)[3]。研究[4]表明，在普通人群的血清、臍帶血和乳汁中可檢測到PFOA，且暴露PFOA會累積到肝、腦、腎等器官[5-7]。已有研究[8-11]證實(shí)，PFOA具有生物生殖毒性、免疫毒性、肝毒性，如誘導(dǎo)肝腫大、糖、脂代謝紊亂，以及神經(jīng)發(fā)育毒性，如PFOA暴露后會影響大腦多巴胺水平以及神經(jīng)元生長和突觸生成相關(guān)蛋白的合成。

蘆丁是一種蘆丁苷，屬于黃酮類化合物，是由槲皮素3位上的羥基與蕓香糖脫水縮合形成，存在于蕎麥、槐米等多種植物中。蘆丁具有多種作用，包括具有強(qiáng)大的清除自由基、抗氧化活性、抗炎性、抗血栓，以及細(xì)胞[12]和神經(jīng)保護(hù)作用[13-15]。已有研究[16]證明，蘆丁可通過直接清除活性氧 (reactive oxygen species，ROS)以防止自由基誘導(dǎo)的損傷。本研究擬探討蘆丁對PFOA造成小鼠大腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1 主要試劑 PFOA(純度96%，Merck，美國)、蘆丁(純度≥98%，百靈威科技有限公司， 北京)、甘油三酯檢測試劑盒、總膽固醇含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)、BSA(純度≥98%，Biosharp， 合肥)、BCA試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、一抗(CST，美國)、二抗(Abcam，美國)。

1.1.2 主要儀器 FA2004電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，上海)；DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝有限公司，寧波)；Synergy2型酶標(biāo)儀(Biotek，美國)、電泳設(shè)備(Bio-Rad，美國)、KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新公司， 合肥)。

1.2 實(shí)驗動物

SPF級雄性ICR小鼠24只[南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0006]，體重18～22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度(21±2)℃，相對濕度50%～70%，給予12 h/12 h(晝/夜)光照周期，小鼠自由取食及飲水。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 動物分組與實(shí)驗處理 24只SPF級雄性ICR小鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為對照組(Ctrl)、PFOA組(PFOA 20 mg/kg·d)、蘆丁干預(yù)組(PFOA 20 mg/kg·d+蘆丁 20 mg/kg·d)，每組8只。每天上午9∶00，用不銹鋼灌胃針經(jīng)口連續(xù)灌胃14 d，每天記錄小鼠體重。14 d后稱量體重，頸椎脫臼處死，迅速取出腦組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗，用濾紙吸干表面水分后用稱重。部分腦組織用4%多聚甲醛溶液固定用于病理切片，部分腦組織用于生化指標(biāo)檢測及蛋白檢測。

1.3.2 腦組織病理切片的制備和觀察 腦組織在4%多聚甲醛溶液固定24 h后，將標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、修片切片后，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及尼氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 甘油三酯、總膽固醇含量及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測每組取5只小鼠大腦部分組織稱重，用生理鹽水漂洗后，以重量(g)/體積(mL)為1/9加入生理鹽水，冰上制備腦組織勻漿，3 500 r/min，4 ℃離心10 min，離心半徑10.5 cm，制備上清液。嚴(yán)格按試劑盒要求，檢測小鼠大腦組織勻漿中甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇含量(total cholesterol，TC)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 用RIPA裂解液提取小鼠大腦組織蛋白后，BCA法測定蛋白濃度，各泳道蛋白上樣量均為40 μg，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件為恒壓80 V，30 min；120 V，1 h，5% BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液和吐溫20緩沖液(Tris-Buffered Saline+Tween 20，TBST)洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜后使用伯樂分子成像儀及化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)顯色蛋白條帶，對目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠大腦組織形態(tài)比較

2.1.1 HE染色結(jié)果 對照組小鼠大腦組織未見異常，染色可見組織結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)元形態(tài)良好，呈圓形、橢圓形，排列均勻，核膜完整，細(xì)胞核深染致密，核仁清晰，形態(tài)正常。細(xì)胞周圍間隙致密無水腫。PFOA組大腦組織有空泡形成并可見部分神經(jīng)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞體積減小，細(xì)胞核固縮、溶解、消失。細(xì)胞間隔增寬、損傷區(qū)結(jié)構(gòu)較疏松、著色變淺。蘆丁干預(yù)組較PFOA組神經(jīng)元形態(tài)稍有恢復(fù)，神經(jīng)細(xì)胞皺縮減少，著色加深(圖1)。

圖1 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠大腦組織HE染色

2.1.2 尼氏染色結(jié)果 對照組尼氏小體數(shù)量較多，均勻分布，大小一致，胞漿有明顯突起,細(xì)胞質(zhì)呈深紫色，神經(jīng)元形態(tài)較好；PFOA組與對照組相比，尼氏小體崩解，數(shù)量明顯減少(P<0.05)，著色淺淡，神經(jīng)元胞體皺縮；而蘆丁干預(yù)組與PFOA組相比，尼氏小體崩解減少，數(shù)量增多(P<0.05)，著色加深，神經(jīng)元形態(tài)較好(圖2)。

圖2 蘆丁干預(yù)PFOA暴露14 d小鼠大腦組織尼氏染色及虎斑結(jié)構(gòu)定量分析

2.2 蘆丁干預(yù)對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織MDA含量、GSH-Px和T-SOD 活性的影響

PFOA組大腦組織中GSH-Px和T-SOD活性低于對照組(P<0.05)。蘆丁干預(yù)組大腦組織中T-SOD活性高于PFOA組、MDA含量低于PFOA組(P<0.05)(表1)。

表1 蘆丁干預(yù)對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性的影響

2.3 蘆丁干預(yù)對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織TC、TG含量的影響

每組小鼠取5個樣本，可見PFOA組小鼠大腦組織中TG含量高于對照組(P<0.05)，蘆丁干預(yù)組小鼠大腦組織中TG含量低于PFOA組(P<0.05)，3組TC含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 蘆丁干預(yù)對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織TC、TG含量的影響

2.4 蘆丁干預(yù)對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

PFOA組半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)的蛋白表達(dá)量較對照組增加，而蘆丁干預(yù)組Caspase3蛋白表達(dá)量較PFOA組降低，與對照組相近(對照組、PFOA組、PFOA+蘆丁組的相對灰度值分別為0.43、0.78、0.43)(圖3)。

圖3 蘆丁對PFOA暴露14 d小鼠大腦組織Caspase3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

PFOA因在環(huán)境中大量存在，且對人和動物存在毒性而備受關(guān)注。大量研究[17-18]證明，PFOA暴露后會對人和動物的脂質(zhì)(脂質(zhì)積累)、脂肪酸和糖代謝造成紊亂，且對肝、腎、腦等器官造成損害。而蘆丁是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[19]。已有研究[20-21]表明，PFOA暴露后對小鼠大腦有明顯毒性，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并導(dǎo)致大腦炎癥。本研究主要觀察PFOA暴露14 d后，小鼠腦部組織的損傷以及脂質(zhì)代謝情況，并初步探討蘆丁對PFOA造成的大腦損傷的保護(hù)作用。

有研究[22]發(fā)現(xiàn)，PFOA可通過調(diào)節(jié)肝臟PPARγ和SREBP2信號通路使TC和TG含量增加，而蘆丁具有一定抗血脂異常的作用[23]，這與本研究結(jié)果吻合。本研究中，小鼠暴露PFOA 14 d后，PFOA組小鼠大腦組織中TG含量高于對照組(P<0.05)，而蘆丁干預(yù)組的大腦組織中TG含量低于PFOA組(P<0.05)，TC含量無明顯變化。脂質(zhì)累積會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，而蘆丁可有效清除氧自由基，并可通過抗氧化和抗炎作用減輕小鼠的腦損傷[13]。小鼠暴露PFOA后刺激大腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧，氧自由基會攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞損傷。MDA是常用的膜脂過氧化指標(biāo)、GSH-Px和T-SOD的底物是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子，可催化超氧陰離子生成無毒性的水和氧氣，從而清除機(jī)體內(nèi)有毒性的活性氧和過氧化氫，阻斷脂質(zhì)過氧化作用[24-25]。PFOA暴露后小鼠大腦組織的GSH-Px和T-SOD活性降低，MDA含量增高(P<0.05)。而蘆丁干預(yù)組T-SOD活性較PFOA組上升，MDA含量明顯降低(P<0.05)。HE染色和尼氏染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，暴露PFOA后小鼠大腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大腦損傷，而蘆丁處理可部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)的氧化損傷。

為進(jìn)一步說明小鼠暴露PFOA后大腦損傷以及蘆丁干預(yù)的作用，本研究對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了分析。Caspase3酶是調(diào)節(jié)炎癥和凋亡信號網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)切蛋白酶家族的成員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者,也是凋亡最主要的終末剪切酶，可協(xié)調(diào)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如DNA片段化或細(xì)胞骨架蛋白降解)[26-27]。凋亡的標(biāo)志之一是Pro-caspase-3的蛋白水解切割成其活性形式Caspase-3。裂解后，Caspase-3易位進(jìn)入細(xì)胞核，在此裂解特定的底物。PFOA暴露后小鼠大腦產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，所以Caspase-3蛋白表達(dá)增加。而蘆丁干預(yù)后清除活性氧，氧自由基減少，對細(xì)胞的損傷減少，所以Caspase-3蛋白表達(dá)降低，這說明蘆丁可減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PFOA暴露可導(dǎo)致小鼠大腦組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)累積，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷增加，凋亡增加。蘆丁對PFOA造成的小鼠大腦損傷有一定的保護(hù)作用。