IL-21、IL-17在IgA腎病的表達與TNF-α、TGF-β及病理分級的關系

曹 麗，鄂 靜，李 晶，肖紅燕，馬丹娜 ，鄭亞莉

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是亞洲人群最常見的原發性腎小球腎炎，臨床及病理表現多樣，是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一[1-2]。白細胞介素-21(IL-21)、白細胞介素-17(IL-17)是新近發現的白細胞介素家族兩個重要的細胞和炎癥因子。研究發現，IL-21、IL-17同處一個自分泌環，均受T輔助細胞17(Th17)分泌和調控，與IgAN起病及進展存在諸多關聯[3]。本研究通過觀察IL-21、IL-17在IgAN血清和腎組織中的表達及與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、病理分級之間的關系，來探討IL-21、IL-17與IgAN免疫炎癥活動和疾病進展的相關性，為尋找評估IgAN免疫炎癥活動的生物標記物，指導臨床合理治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料：IgAN組：納入我院2018年10月-2020年6月經腎穿刺活檢首次明確診斷為IgAN的患者73例，其中男性52例，女性21例，平均年齡(37.8±13.1)歲。排除其他急慢性腎炎，合并有糖尿病、高尿酸血癥、高脂血癥等代謝性疾病，合并有自身免疫系統性疾病、感染性疾病、肝病、腫瘤和六個月內曾服用或正在服用糖皮質激素或免疫抑制劑的患者。正常對照組：我院泌尿外科既往無任何疾病，因腎外傷行腎切除患者40例，其中男性28例，女性12例，平均年齡(35.6±11.2)歲。2組患者一般情況差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

血清及腎組織標本：收集2組患者清晨空腹靜脈血，離心后收集血清，分裝保存于-80 ℃冰箱待檢；收集IgAN患者腎穿刺組織標本，分別用無菌鹽水紗布包裹，分裝PVC管密封冰盒轉運至-80℃冰箱保存。其中IgAN組收集到腎組織標本17例，正常對照組收集15例。標本收集前已征得患者本人及家屬同意，并經醫院倫理委員會審查通過(倫理審批編號：2020-KY-118)。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑:IL-21、IL-17 ELISA檢測試劑盒購自Abcam公司(ab119542、ab100556)，RNA裂解液Trizol試劑購自Invitrogen公司(#15596026)，總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司(#DP419)，逆轉錄cDNA試劑盒購自Takara公司(#RR036A)，SYBR熒光染料購自Takara公司(#RR820A)。IL-21單克隆抗體購自Abcam公司(ab5978)、IL-17單克隆抗體購自Abcam公司(ab79056)、TNF-α單克隆抗體購自NOVUS公司(NBP1-19532SS)、TGF-β單克隆抗體購自Santa cruz公司(sc-130348)，DAB顯示試劑盒(ZLI-9018)、通用二步法檢測試劑盒(PV-9000)、正常山羊血清(ZLI-9022)、蘇木素染色液(ZLI-9610)均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2 ELISA法檢測2組血清IL-21、IL-17的表達:2組備用血清樣本恢復至室溫，按照ELISA檢測試劑盒的操作步驟，將已制備的標準品工作液和血清待測樣品分別加入已包被抗體的96孔板中，每孔100 μL，且重復做兩個復孔(若樣本濃度高于檢測范圍，需用樣本稀釋液稀釋后取樣)，酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去孔內液體，甩干后每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，酶標板覆膜，37 ℃溫育1 h；洗板：甩盡孔內液體，每孔加入洗滌液250 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶標板內液體，在厚的吸水紙上拍干，重復此洗板步驟3次；加入酶結合工作液100 μL，加蓋覆膜37 ℃溫育30 min；棄去孔內液體，甩干，按照上述洗板步驟洗板5次；加入底物溶液(TMB)90 μL，覆膜后37 ℃避光孵育6 min；加入終止液50 μL終止反應；立即用酶標儀在波長450 nm處測量各孔的光密度值(OD值)。

1.2.3 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測2組冰凍腎組織IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-βmRNA 的表達：將儲存于-80℃冰箱的腎組織標本解凍，在研磨碗中加入1 mL RNA裂解液(Trizol)充分研磨組織呈粉末狀，將液體收集至1.5 mL無酶EP管中，加入200 μL氯仿劇烈振蕩，使其充分乳化，室溫靜置5 min，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min。出現分層現象后吸取上清至新的EP管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，靜置5 min，4 ℃ 12 000 rpm離心20 min。棄去上清保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，7 500 rpm離心5 min，棄上清后放置超凈工作臺中使乙醇揮發干燥，根據沉淀量加入適當的滅菌超純水溶解RNA沉淀。65 ℃金屬浴作用5 min促使沉淀完全溶解，渦旋混勻后上機檢測RNA的濃度和純度。利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，置于-80℃冰箱長期保存備用。以cDNA作為模板，PCR擴增檢測，反應條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。利用2-△△Ct方法計算各基因mRNA的相對表達量。

1.2.4 免疫組化法(IHC)檢測IgAN組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α的表達：將石蠟包埋的IgAN患者腎組織標本切成厚度為3 μm的切片，放入100%二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各作用10 min，常規脫蠟后依次放入梯度酒精中各作用5 min，自來水清洗干凈。微波爐中加入檸檬酸鈉抗原修復液對切片進行抗原修復處理，PBS沖洗切片后將其放入3% H2O2溶液中室溫作用10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS緩沖液清洗3次，滴加山羊血清封閉液室溫封閉1 h，去除非特異性背景染色。棄去封閉液，滴加適量的一抗釋稀液：抗IL-21單克隆抗體(1∶100，Abcam)、抗IL-17單克隆抗體(1∶100，Abcam)、抗TNF-α單克隆抗體(1∶50，NOVUS)，4 ℃孵育過夜。去除一抗后滴加100 μL反應增強液，室溫孵育20 min,PBS溶液清洗后滴加增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG二抗聚合物溶液，室溫孵育2 h，促使抗原抗體發生特異性結合。PBS緩沖液清洗,加入適量新鮮配置的DAB顯色液,顯微鏡下觀察染色程度,適時終止染色反應。自來水沖洗后將切片放蘇木素雜色液中作用30 s，鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗反藍。梯度酒精脫水、二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。

2 結果

2.1 2組患者血清中IL-21、IL-17的表達：與正常對照組(Control組)相比，IgAN組患者血清中IL-21、IL-17表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 2組患者腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β的表達:與Control組相比，IgAN組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)。

2.3 IgAN組腎組織IL-21、IL-17與TNF-α、TGF-β之間的相關性: IgAN組腎組織中IL-21表達與TNF-α呈正相關(r=0.895，P<0.05)；與TGF-β沒有相關性(r=0.405，P>0.05)。IL-17表達與TNF-α呈正相關(r=0.677，P<0.05)，與TGF-β沒有相關性(r=0.096，P>0.05)，見表1。

2.4 免疫組化法檢測2組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α的表達:對照組IL-21、IL-17、TNF-α表達呈陰性，IgAN組IL-21、IL-17、TNF-α表達呈陽性，主要定位于腎小管上皮細胞，腎小球細胞中基本不表達，且IL-21、IL-17、TNF-α隨病理分級加重,表達強度逐漸升高，見圖1(封三)。

3 討論

CD4+T細胞亞群的主要效應細胞Th17所介導的免疫炎癥反應和慢性腎炎及IgAN的起病及進展已廣受關注[4]。已有研究顯示，Th17及其主要效應因子IL-17可通過調控核轉錄因子NF-kB信號通路參與并加劇免疫炎癥反應,導致腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞損傷，腎功能惡化[5]。Zeng R等研究也發現，Th17可分泌和調控IL-21，IL-21通過JAK-STAT3信號通路誘導腎臟上皮細胞和成纖維細胞增殖，促進炎癥反應和腎組織纖維化的形成[6]。同處Th17分泌和調控的自分泌環中的IL-21、IL-17一旦激活可相互協同，相互促進，并逆向激活加速Th17增殖和分化，共同參與和促進免疫系統疾病的發生和進展[7-8]。我們前期的研究中也發現[9]，IL-21、IL-17在IgAN患者血清中表達與蛋白尿、腎功能、血尿酸呈正相關，提示IL-21、IL-17可能參與IgAN臨床免疫炎癥活動的發生。本研究顯示，IgAN患者血清及腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β表達均較對照組明顯升高，且IL-21、IL-17表達和傳統的對炎癥刺激反應最快，產生最早的促炎因子TNF-α呈正相關，與TGF-β沒有相關性，表明IL-21、IL-17可能和IgAN患者炎癥反應關系密切，尤其可能和IgAN患者的早期炎癥反應相關。

TGF-β是傳統的免疫穩態炎癥調控因子和纖維化因子[10]，正常生理情況下，當機體存在異常免疫炎癥反應時，激活T調節細胞(Treg)分泌TGF-β發揮負向免疫穩態調控作用，防止免疫反應過激。但當調控失效，免疫炎癥反應持續存在時，TGF-β則反向激活Th17并介導其下游炎癥因子IL-21誘導B淋巴細胞持續轉分化為IgA型漿母細胞，促進成纖維細胞增殖分化，導致IgAN腎小管萎縮，腎間質纖維化，腎功能惡化[11-12]。以上研究結果說明TGF-β可能是較為晚期的免疫炎癥調控因子，當免疫炎癥反應過激時最終以纖維化形式終止炎癥反應。本研究結果中IL-21、IL-17的表達與TNF-α呈正相關，與TGF-β沒有相關性，進一步通過免疫組化技術檢查顯示盡管腎小球未發現IL-21、IL-17、TNF-α的表達，但在腎小管上皮細胞均呈陽性表達，且病理分級越高表達越強，由此驗證了既往研究結果，也從側面說明IL-21、IL-17可能是較早期敏感的評估IgAN免疫炎癥活動的生物標志物。

IgAN的病理顯示主要為腎小球病變，本研究未發現IL-21、IL-17、TNF-α在腎小球表達，可能和其信號通路有關。在后續研究中我們將進一步擴大樣本量，增加研究方法，并結合其他基礎研究尋找其作用的信號通路深入探討IL-21、IL-17和IgAN免疫炎癥活動的關系，為后續尋找評估IgAN炎癥活動生物標志物奠定基礎。