兒童卵黃囊瘤病因研究進(jìn)展

許恬逸 綜述 董 瑞 審校

卵黃囊瘤（yolk sac tumor，YST），又稱內(nèi)胚竇瘤（endodermal sinus tumor），是一種分化為尿囊、胚胎卵黃囊和胚胎外間葉的生殖細(xì)胞腫瘤，60%～70%于3歲以前發(fā)病［1］。YST作為兒童惡性生殖細(xì)胞腫瘤中最常見的一種類型，其惡性程度高、病情進(jìn)展快，且極易血行轉(zhuǎn)移［2］。YST可廣泛發(fā)生在人體各個(gè)部位，以性腺最為常見，除性腺外，盆腔和骶尾部為多見，還可以發(fā)生于大腦、脊髓、縱隔、腹膜后、頭頸部等部位［1，3］。諸多學(xué)者對該病致病機(jī)理及治療進(jìn)行了大量研究，但其確切病因至今尚不明確。本文就目前國內(nèi)外兒童卵黃囊瘤的病因?qū)W研究進(jìn)行綜述。

一、遺傳因素

（一）基因突變

1.SALL4基因突變：人類SALL4基因位于20q13.13-q13.2。其中SALL4A（編碼1053個(gè)氨基酸）具有全部4個(gè)外顯子，包含4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc Finger，ZF1～ZF4）；SALL4B（編碼617個(gè)氨基酸）是通過另一個(gè)剪接供體位點(diǎn)產(chǎn)生的，該位點(diǎn)可導(dǎo)致大量外顯子2和只包含ZF1與ZF4的蛋白缺失；SALL4C（編碼277個(gè)氨基酸）沒有外顯子2，它編碼的版本只有ZF1［4］。

關(guān)于SALL4的具體突變形式，相關(guān)研究較少。已有報(bào)道中SALL4突變都是雜合的，且均位于外顯子2和外顯子3中，而在外顯子1或外顯子4中尚未發(fā)現(xiàn)突變。這些是無意義的突變、短重復(fù)或缺失。除此之外，還有2例在ZF4基因簇編碼區(qū)發(fā)生的SALL4錯(cuò)義突變。尚無文獻(xiàn)報(bào)道人類SALL4基因內(nèi)的純合突變，可能是因?yàn)檫@種突變會(huì)導(dǎo)致早期的胚胎致死。

Sal-like蛋白4（spalt like transcription factor 4，SALL4）是一種在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在早期胚胎發(fā)育過程中具有重要作用，能聯(lián)合其他多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（recombinant octamer binding transcription factor 4，OCT4）、Nanog同源框（nanog homeobox，NANOG）和Y染色體性別決定盒基因轉(zhuǎn)錄因子2（SRY-Box transcription factor 2，SOX2）等，構(gòu)成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新能力［5，6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SALL4在卵黃囊瘤中呈高表達(dá)［2］。且已有多次實(shí)驗(yàn)證明，相比傳統(tǒng)標(biāo)記物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、胎盤堿性磷酸酶（placental alkaline phosphatase，PLAP）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3）等，SALL4是一個(gè)非常敏感的新興標(biāo)記物，不論YST是發(fā)生在性腺還是性腺外，其敏感度均接近100%［7，8］。

一方面，SALL4在癌細(xì)胞中充當(dāng)細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SALL4敲低會(huì)誘導(dǎo)人類多種癌細(xì)胞大量凋亡或顯著抑制其生長。此外，SALL4的下調(diào)導(dǎo)致癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡，而過表達(dá)SALL4的癌細(xì)胞會(huì)通過細(xì)胞周期蛋白D1和D2的上調(diào)，表現(xiàn)出細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和G1期細(xì)胞數(shù)量減少的特征。

比如，SALL4通過募集核小體改構(gòu)復(fù)合體（nucleosome remodeling complex，NuRD）復(fù)合物，與NuRD元件組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase2，HDAC2）共同占據(jù)其靶基因PTEN啟動(dòng)子區(qū)域，抑制PTEN基因轉(zhuǎn)錄和翻譯形成的mRNA以及蛋白的水平。而PTEN基因是一種抑癌基因，可在許多癌癥中抑制磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）經(jīng)典信號通路。有實(shí)驗(yàn)證明，SALL4被阻斷時(shí)PTEN表達(dá)明顯上調(diào)，即PTEN與SALL4呈負(fù)相關(guān)。因此，當(dāng)SALL4上調(diào)時(shí)，PTEN基因表達(dá)下降，則PTEN對PI3K/AKT信號的抑制作用減弱，從而減弱了在G1期阻滯細(xì)胞周期的D1循環(huán)水平，促進(jìn)了腫瘤增殖［9］。

另一方面，SALL4對于維持癌癥干細(xì)胞的特性也至關(guān)重要。有研究表明，SALL4可以與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）結(jié)合并上調(diào)WNT（Wingless Int1）/βcatenin途徑靶基因的表達(dá)，即SALL4可能通過與βcatenin的相互作用促進(jìn)干細(xì)胞自我更新并抑制干細(xì)胞分化。此外，STAT3有激活介導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性的功能，SALL4可與STAT3相互作用以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化；刺猬信號通路在器官發(fā)生和分化過程中起關(guān)鍵作用，SALL4可以調(diào)節(jié)音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號傳導(dǎo)，以防止干細(xì)胞分化［10］。

SALL4作為一種轉(zhuǎn)錄因子可以激活OCT4，并通過形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物與NANOG相互作用。當(dāng)OCT4與SALL4啟動(dòng)子的-290至＋1之間的區(qū)域結(jié)合后，OCT4的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)SALL4啟動(dòng)子的活性，即OCT4與SALL4形成了可以相互激活的正反饋回路［11］。而OCT又具有維持干細(xì)胞多能性并促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，所以SALL4也可以通過這一途徑加速癌癥進(jìn)程。因此，SALL4基因發(fā)生突變后，可能會(huì)通過多種途徑加速卵黃囊瘤細(xì)胞增殖，提高其發(fā)病率［12］。

2.SOX家族基因突變：在哺乳動(dòng)物中，SOX基因從A到H分為八類［13］。SOX2基因位于3q26.33［14］。有研究表明，SOX2可以協(xié)同轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞，使其變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。同時(shí)，它還是腫瘤中的擴(kuò)增基因，其過表達(dá)可導(dǎo)致惡性過程的發(fā)生，從而誘發(fā)腫瘤形成。SOX2還參與了一些復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑，Chen等［15］研究表明，SOX2可以與β-catenin協(xié)同上調(diào)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1），從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。其他研究還表明，NANOG、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）和OCT4也被作為SOX2的靶標(biāo)，而這些物質(zhì)又能夠促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的自我更新和癌癥細(xì)胞的增殖［16，17］。除此之外，SOX2還與微小RNA（microRNA，miRNA）有緊密聯(lián)系，它主要受miRNA-145、miRNA-126和miRNA-9基因家族的控制［18-20］。同時(shí)SOX2也可以調(diào)控miRNA，包括下調(diào)miR-143、miR-145、miR-253-5p和miR-452，從而形成一個(gè)雙重負(fù)反饋回路［21］。

SOX17基因位于8q11.23，在研究中被認(rèn)定是WNT信號通路傳導(dǎo)的“拮抗劑”［14，22，23］。WNT/βcatenin途徑本身可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而SOX17則通過直接轉(zhuǎn)錄抑制CTNNB1（編碼β-catenin基因），在蛋白質(zhì)水平上的直接競爭干擾β-catenin/轉(zhuǎn)錄蛋白（transcription factor，TCF）相互作用，誘導(dǎo)β-catenin蛋白酶體降解和轉(zhuǎn)錄抑制β-catenin/TCF復(fù)合物的共激活因子等可能方式，來實(shí)現(xiàn)對WNT/β-catenin途徑的抑制，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用［24］。

根據(jù)已有的研究報(bào)告，上述兩種基因的突變包括三種，分別是錯(cuò)義突變、無義突變和移碼突變，而引起腫瘤的原因主要是錯(cuò)義突變［25］。當(dāng)錯(cuò)義突變發(fā)生時(shí)，由于SOX2和SOX17相應(yīng)蛋白質(zhì)上調(diào)和下調(diào)，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖并可能進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

3.OCT4基因突變：OCT4也被稱為OCT3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員［26］。OCT4基因是胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因，人的OCT4基因位于6號染色體上（6p21.31），長度為16.40 kb，具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄成不同的mRNA亞型，進(jìn)而翻譯為多種蛋白質(zhì)［27］。

OCT4是與癌癥干細(xì)胞自我更新和分化相關(guān)的因子之一。實(shí)驗(yàn)證明，OCT4蛋白在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非癌組織，而敲除OCT4不僅顯著降低了癌細(xì)胞的增殖活性，還會(huì)明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲潛力［28］。OCT4可以與AKT1基因的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，而一旦OCT4被AKT在其T235位點(diǎn)磷酸化，磷酸化的OCT4將與AKT1啟動(dòng)子解離，從而激活A(yù)KT1轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)細(xì)胞存活。由此可知，T235磷酸化的OCT4（OCT4-pT235）水平與AKT水平呈正相關(guān)［29］。而PI3K/AKT信號傳導(dǎo)對于癌癥干細(xì)胞的自我更新和腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要。因此，OCT4可能是通過AKT參與了癌癥的進(jìn)程［30］。

此外，OCT4還可以直接結(jié)合T細(xì)胞白血病/淋巴瘤蛋白（T cell leukemia/lymphoma protein，TCL1）基因的啟動(dòng)子區(qū)域并激活其轉(zhuǎn)錄。TCL1可以與AKT相互作用并完全激活A(yù)KT，從而維持癌癥干細(xì)胞的存活。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明，敲除OCT4會(huì)使癌細(xì)胞的耐藥性降低，而過表達(dá)OCT4會(huì)通過提高TCL1的表達(dá)并激活A(yù)KT途徑增加癌細(xì)胞的抗凋亡能力，這對腫瘤的治療以及預(yù)后都可能產(chǎn)生影響［31］。

4.LIN28基因過表達(dá)：LIN28蛋白具有兩種類型的RNA結(jié)合基序，分別是冷休克結(jié)構(gòu)域（cold shock domain，CSD）和Cys-Cys-His-Cys（cysteine-cysteine-histidine-cysteine，CCHC）鋅指結(jié)構(gòu)域，它們共同參與一般mRNA的結(jié)合［32］。哺乳動(dòng)物產(chǎn)生兩個(gè)LIN28旁系同源物L(fēng)IN28A和LIN28B，它們分別或共同參與各種生物學(xué)功能［33］。

LIN28是一種必需的RNA結(jié)合蛋白，在胚胎干細(xì)胞中普遍表達(dá)，它的生理功能與干細(xì)胞的分化發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生有關(guān)。LIN28的致癌特性受到包括miRNA和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多個(gè)上游調(diào)控因子的影響，比如轉(zhuǎn)錄因子C-myc和N-myc都可以與LIN28B啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)節(jié)LIN28B的表達(dá)，并且建立了直接的N-myc/LIN28B和C-myc/LIN28B調(diào)控的伙伴關(guān)系［34］。

Let-7基因是一種抑癌基因［35］。有研究發(fā)現(xiàn)，LIN28可以阻斷幾種miRNA的生物加工，其中包括Let-7家族的多個(gè)成員［36，37］。LIN28A/B可以使用CSD和CCHC結(jié)構(gòu)域來阻斷prilet-7和prelet-7的生物發(fā)生［32，38，39］。在細(xì)胞質(zhì)中，LIN28A/B可以通過核糖核酸內(nèi)切酶與pre-let-7末端環(huán)的相互作用來阻斷Let-7的加工，而成熟的Let-7家族成員可以通過直接靶向LIN3的3'-UTR來抑制LIN28的表達(dá)，即LIN28/Let-7軸被認(rèn)為是調(diào)節(jié)各種生物學(xué)功能的雙負(fù)反饋回路［36，40，41］。因此，LIN28基因過表達(dá)可以通過抑制Let-7miRNA來加速腫瘤的發(fā)生。

除此之外，過度激活的LIN28B可以通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）的水平來促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)程［40］。其次，在癌癥干細(xì)胞中，LIN28B及其調(diào)節(jié)劑IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKKβ）可以通過與WNT/TCF7信號通路相互作用來維持癌細(xì)胞的干性［42］。

有實(shí)驗(yàn)證明，LIN28在小兒卵黃囊瘤中表達(dá)上調(diào)，是該腫瘤的敏感標(biāo)志物，可用于將其與成熟畸胎瘤區(qū)分［43］。因此，LIN28基因的過表達(dá)可能是導(dǎo)致YST發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素之一［44］。

5.其他相關(guān)基因：有研究表明，兒童睪丸卵黃囊瘤中通常有RUNX3啟動(dòng)子的高甲基化，而成人生殖細(xì)胞腫瘤中少有發(fā)生。對兒童睪丸卵黃囊瘤患者，RUNX3 mRNA在正常的對照睪丸中有表達(dá)，而在病例的正常睪丸組織中卻檢測不到甲基化。以上證據(jù)表明RUNX3基因可能是兒童睪丸卵黃囊瘤的抑制基因。研究表明，PRDM14可與OCT4、SOX2和NANOG一起參與人類多能性核心網(wǎng)絡(luò)的組成，因此其相關(guān)基因的異常也可能引起卵黃囊瘤的發(fā)生［45］。除此之外，還有KITLG、SPRY4、BAKI、DMRTI等基因也可能與該腫瘤相關(guān)［46］。

（二）染色體變異

在關(guān)于兒童卵黃囊瘤的染色體報(bào)告中，最常見失衡是1q和20q染色體上的重復(fù)以及1p和6q染色體上的丟失。除此之外，還包括染色體3p的重復(fù)以及染色體4q、18q和20p的丟失［47，48］。但是這些通過實(shí)驗(yàn)檢測出的特征性染色體變異具體如何通過基因表達(dá)影響腫瘤的發(fā)展還有待進(jìn)一步研究。

二、表觀遺傳學(xué)因素

1.DNA甲基化：DNA甲基化異常是許多癌癥的重要特征，由于在生殖細(xì)胞正常發(fā)育過程中發(fā)生廣泛的表觀遺傳重編程［49］。同樣，DNA甲基化異常在兒童YST中也發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，YST在大量與癌癥相關(guān)的基因中表現(xiàn)出啟動(dòng)子甲基化，其中包含許多與生殖細(xì)胞生物學(xué)高度相關(guān)的基因，如TCF4、WNT10B、BDNF、FGF2、BMP3、FZD9、WNT2、APC、SOX2、NTRK2、NTRK3、TGFB3、TGFB2、WNT1、PDGFRB等，其中包括3個(gè)重要的抑癌基因（APC、RUNX3和HIC1）［50］。這些基因啟動(dòng)子的甲基化會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄翻譯的過程，從而導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白質(zhì)無法正常表達(dá)［51］。同時(shí)，卵黃囊瘤中甲基化程度較高的CpG基因位點(diǎn)上，顯著富集了與胚胎干細(xì)胞多能性和發(fā)育信號通路相關(guān)的基因，例如PTEN、PDGF和NF-κB［50］。還有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)印跡基因和17個(gè)抑癌基因的甲基化水平存在差異，在YST中發(fā)生異常的表觀遺傳重編程［52］。因此，以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)也有可能引起YST的發(fā)生。

2.miRNA：miRNA是小的內(nèi)源性非編碼RNA在特定的細(xì)胞類型和發(fā)育階段調(diào)節(jié)基因功能的方式。miRNA在轉(zhuǎn)錄后翻譯中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，因此它的差異性表達(dá)與人類癌癥有關(guān)［53］。已有多篇論文闡述miR-371-373和miR-302簇與生殖細(xì)胞腫瘤有一定相關(guān)性，其中miRNA-372和miRNA-373通過與p53途徑的相互作用，特別是通過調(diào)節(jié)LATS2，在GCT中作為癌基因發(fā)揮作用，而miR-302簇則可調(diào)節(jié)淋巴結(jié)抑制因子左右決定因子1（leftright determination factor 1，LEFTY1）和LEFTY2，從而在胚層規(guī)范中發(fā)揮重要作用［54］。此外，還發(fā)現(xiàn)miRNA-122、miR-200b、miR-200c、miR-375和miR-638等在卵黃囊瘤中過度表達(dá)，這些miRNA的上調(diào)/下調(diào)可能也在一定程度上導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生［55，56］。

3.印記基因：已知在從原始生殖細(xì)胞正常發(fā)育成性腺細(xì)胞/卵母細(xì)胞的過程中會(huì)發(fā)生印跡清除，因此據(jù)推測，當(dāng)其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，腫瘤細(xì)胞的印跡狀態(tài)可能反映了原始生殖細(xì)胞的發(fā)育階段。IGF2和H19（分別在母本和父本上印記）是迄今為止研究最廣泛的印記基因。有研究應(yīng)用甲基化敏感性單核苷酸引物延伸技術(shù)研究了這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)所有惡性生殖細(xì)胞瘤在IGF2／H19的印跡控制區(qū)域均發(fā)生了甲基化。因此印跡基因的甲基化及其表達(dá)的改變極有可能與兒童YST的發(fā)生有關(guān)［57］。

三、綜合征伴發(fā)因素

有研究表明，患有克萊氏綜合征（47，XXY）的男性兒童更有可能發(fā)展成YST，尤其是縱隔腫瘤［58］。雖然確切的致癌原因還不清楚，但無疑提示了X染色體對YST的潛在作用。此外，患有特納綜合征（46，XY）的女性兒童也有更大概率發(fā)展成惡性生殖細(xì)胞瘤，這與其Y染色體序列有一定的相關(guān)性［59］。純性腺發(fā)育不全以及其他一些性染色體疾病也可能與兒童YST的發(fā)生有關(guān)［60］。

四、其他因素

一項(xiàng)研究表明，亞裔/太平洋島民和西班牙裔兒童的卵黃囊腫瘤發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)最高，出生時(shí)年齡≤19歲的年輕母親其孩子患YST的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)有所增加［61］。同時(shí)，兒童YST也被認(rèn)為與環(huán)境有關(guān)。有研究表明，若父母日常工作、生活的環(huán)境可能接觸有機(jī)溶劑，如苯、甲苯、二氯甲烷等，或者母親懷孕時(shí)暴露于類似環(huán)境中，這些溶劑會(huì)影響性腺相關(guān)激素的分泌，從而導(dǎo)致孩子患YST的概率增加［62］。

綜上所述，兒童YST的發(fā)生原因較為復(fù)雜，可能是遺傳、發(fā)育、環(huán)境等多重因素導(dǎo)致的結(jié)果。相對而言，相關(guān)基因的異常改變應(yīng)是所有病因中的關(guān)鍵，但現(xiàn)在針對該方面的研究還較匱乏。因此，還需要更多樣本及更深入的研究來明確YST的致病因素并闡明其致病機(jī)制，為YST的診斷、治療以及預(yù)后提供最大程度的幫助。