椎間盤軟骨終板干細胞衰老初探*

劉 寧 陳 勤 伍耀宏 江西省贛州市人民醫院 341000

脊柱退行性疾病是骨科常見疾病，目前認為椎間盤退變是這一系列脊柱退行性疾病的病理基礎。嚴重影響患者的生活質量，給社會帶來巨大的經濟負擔。由于椎間盤的退變，椎間盤的生物力學發生了顯著變化，椎間盤間隙的高度降低，導致脊柱不穩、椎間盤突出、脊髓或神經根受壓，引起肢體疼痛、麻木等癥狀[1-3]。軟骨終板可以維持椎體的正常形態，防止髓核向相鄰椎體凸出，保護椎體在承受壓力時避免壓迫性骨萎縮。同時，軟骨終板能夠吸收來自脊柱負重的靜態壓力。軟骨終板作為椎間盤的主要營養途徑，通過滲透作用為椎間盤提供營養和體液交換[4]。目前，椎間盤干細胞已成為研究的焦點，軟骨終板中干細胞的存在引起了臨床研究者的關注[5]。細胞衰老是指細胞周期的阻滯，衰老相關標志物的表達以及衰老相關通路的激活，如p53-p21、p16等，在機體變性中起著非常重要的作用。近年來的研究表明，干細胞的老化是組織變性或器官疾病的重要原因。研究證實了軟骨終板干細胞存在于人類椎間盤終板組織中[6]。然而，軟骨終板干細胞在衰老過程中的存在國內外鮮有報道，其在椎間盤退變中的作用機制尚不清楚。因此，本研究將通過檢測不同年齡組獲得的人軟骨終板干細胞的增殖活性、周期停滯、細胞衰老等指標來驗證人軟骨終板干細胞的衰老現象。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集了本院2020年1—5月因腰椎間盤退變性疾病行腰椎間盤摘除術植骨融合的30例臨床標本，女13例，男17例，年齡35～58歲，將其按不同年齡段分為高年齡組(≥46歲，n=16)和低年齡組(<46歲，n=14)。高齡組中男9例，女7例，平均年齡(51.69±4.09)歲；低齡組中男8例，女6例，平均年齡(40.64±3.77)歲。所有患者均行腰椎MRI等常規檢查判斷椎間盤退變程度，且既往無腰痛病史，本研究所需標本均經患者或家屬簽字同意, 并得到醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器 倒置顯微鏡(青島富堡精密儀器有限公司)、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(上海研生實業有限公司)、CCK-8 試劑盒(翌圣生物科技有限公司)、酶標系統多功能儀(青島聚創環保有限公司)、流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司)、一次性培養皿(山東博科控股集團)、PBS緩沖液(東莞市斯巴達化學有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 軟骨終板干細胞提取、培養：取軟骨終板，去除周圍纖維環、髓核和軟骨。清洗后，用PBS清洗。將部分組織放入玻璃皿中，加入透明質酸酶和Ⅱ型膠原酶消化液。細胞在37℃培養箱中培養過夜。然后將消化塊加入培養基中，收集細胞懸浮液，離心10min，丟棄上清液，將細胞重新懸浮并在培養皿中培養。

1.3.2 β-半乳糖苷酶染色法觀察細胞形態和衰老活性：培養孔板中的培養基清除，用 PBS清洗細胞2次，加入染色固定液，固定15min，PBS清洗3次，3min/次，加人工作液混勻后，滴加至細胞培養板中，覆蓋所有的細胞，37℃孵箱孵育過夜，PBS清洗后，顯微鏡下觀察染色情況，記錄染色結果，采用 ImageJ軟件進行分析。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期阻滯情況：將中板軟骨細胞常規胰酶消化、收集、離心(1 000r，5min)；再用PBS緩沖液沖洗后再次離心5min，加入乙醇溶液后固定24h，然后用流式細胞儀檢測，最后分析計算結果。

1.3.4 CCK-8檢測各組細胞的增殖活性：為驗證所分離出細胞的增殖能力，采用CCK-8實驗檢測細胞的活力，向每個小孔內滴加10μl CCK-8顯色溶液，然后置于細胞培養箱內。分別于12h、24h后，迅速在酶標儀上檢測每組細胞的OD值。

2 結果

2.1 兩組椎間盤軟骨終板干細胞的形態比較 低年齡組椎間盤終板軟骨細胞呈圓形、多角形，形態較飽滿，高年齡組細胞形態明顯細長、較扁，呈長梭形改變，呈明顯的退變形態。見圖1。

圖1 各組軟骨終板干細胞的形態

2.2 兩組衰老細胞陽性比比較 高年齡組衰老細胞陽性比為(73.6±3.56)%，明顯高于低年齡組的(35.4±2.89)%，差異有統計學意義(t=31.94，P<0.05)。

2.3 兩組細胞周期情況比較 高年齡組的G1期細胞比和(S+G2/M)期細胞比均低于低年齡組(P<0.05)。說明高年齡組的細胞周期阻滯情況較低年齡組更明顯。見表1。

表1 兩組細胞周期情況比較

2.4 兩組細胞的增殖活性比較 高年齡組的12hOD、24hOD均低于低年齡組(P<0.05)。說明高年齡組的軟骨干細胞增殖活性低于低年齡組。見表2

表2 兩組細胞OD值比較

3 討論

臨床上椎間盤退變導致的脊柱疾病很常見，正在不同程度地影響著70%以上的年輕人，致殘率較高，極大降低患者生活質量[7]，目前，主要的治療策略是椎間盤切除術。近年來，椎間盤退變的細胞替代療法和組織工程已成為研究的熱點。隨著間充質干細胞作為細胞替代治療的理想種子細胞的發現，軟骨終板干細胞的發現為椎間盤退行性細胞治療的種子細胞提供了新的選擇[8]。雖然已經發現導致椎間盤退變的因素很多，如遺傳因素、機械負荷、炎癥因素等，但椎間盤退變的確切機制尚不清楚。目前有大量研究認為細胞衰老與椎間盤退變有非常重要的關系，細胞衰老可能是椎間盤退變的重要影響因素[9-10]，特別是椎間盤的髓核和纖維環。β-半乳糖苷酶陽性細胞可見于退變椎間盤的髓核和纖維環中，β-半乳糖苷酶陽性細胞數量的減少和細胞的復制潛能與椎間盤的退變程度密切相關[11]。然而，尚未見椎間盤軟骨老化的報道。椎間盤的終板被認為是椎間盤的營養通道。因此，椎間盤終板的退變和鈣化會降低其均勻傳遞的能力，阻礙NP營養物質的擴散，誘發或加速椎間盤的退變。因此，探討椎間盤終板軟骨細胞的老化對椎間盤退變具有重要意義，可以更好地指導椎間盤退變的預防，使部分患者可以避免手術治療。

在本研究中，高年齡組細胞形態的退變程度要高于低年齡組，說明隨著年齡的增加，軟骨細胞的退變會更加明顯，在β-半乳糖苷酶染色法中，高年齡組衰老陽性細胞比明顯高于低年齡組；高年齡組細胞增值率低于低年齡組，而且周期阻滯強于低年齡組，以上研究結果表明，軟骨終板中干細胞的衰老現象是存在的，并且隨著年齡的增加軟骨細胞的代謝、增值率降低，這造成了軟骨細胞的數量減少，從而間接引起臨近細胞的凋亡。有學者指出，軟骨終板是作為椎間盤最重要的組成部分而存在，是維持其正常形態的重要因素，其退變過程是一個多因素的復雜過程，主要與年齡、局部炎癥因子、終板軟骨細胞功能等因素相關[4]。研究指出，軟骨終板細胞凋亡的增加,使單位體積內細胞數量減少,細胞外基質含量也下降,軟骨終板物理結構、化學成分及生物效應發生變化,軟骨終板細胞外基質產生的有效膠體滲透壓不能穩定維持,營養代謝紊亂,軟骨終板骨化,加快了終板組織變形,同時變形加快了細胞凋亡,形成惡性循環,最終導致細胞密度顯著降低，并持續鈣化、骨化,脆性增加而出現裂隙和破壞[12]。這也與本文研究結果相一致。

綜上所述，椎間盤軟骨終板干細胞存在衰老現象，具體表現為細胞形態的退變、細胞周期改變、增殖能力下降等。且椎間盤軟骨終板干細胞的衰老現象會隨著年齡的增長而愈發明顯，這為椎間盤退變的預防提供了較好的指導，具有重要的臨床意義。