熒光定量PCR檢測方法在結核性腦膜炎檢測中的應用

毋傳鏗 河南省焦作市第三人民醫院檢驗科 454500

結核性腦膜炎屬于較嚴重的結核性疾病，是由于結核分枝桿菌感染腦部組織引起的非化膿性炎癥。該細菌屬于兼性細胞內致病菌，能夠引起諸多無癥狀潛伏感染和進行性疾病[1]。在其感染類型中，結核性腦膜炎是常見的肺外結核感染類型之一，但兒童感染致死率較高[2]。結核性腦膜炎在初次感染1年內發病率最高，由于臨床癥狀不典型，缺乏特異性的診斷指標，易被誤診為化膿性腦膜炎、病毒性腦炎及腦部腫瘤等。由于結核性腦膜炎病情發展迅速、早期不易明確診斷及預后不良等情況，亟需尋找快速準確的診斷方法。近年來，分子生物學在臨床檢驗上得到了廣泛應用，熒光定量PCR技術已經能夠對各種病原學做出快速準確診斷[3]。本文中采用熒光定量PCR檢測、抗酸染色涂片法及MTB培養法3種檢測方法進行對比分析，探討熒光定量PCR檢測方法在結核性腦膜炎診斷中的意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月—2020年6月在我院就診的具有腦膜刺激征患者104例，其中男50例，女54例，年齡26～55歲，平均年齡(39.4±16.6)歲。根據是否確診對其進行分組，其中非結核性腦膜炎組32例(病毒性腦膜炎13例、化膿性腦膜炎12例、腦部腫瘤7例)，確診結核性腦膜炎組48例，疑似結核性腦膜炎組24例。對三組患者進行腰椎穿刺術留取腦脊液5ml，及時送檢。

1.2 納入標準 確診結核性腦膜炎標準：(1)經影像學檢查，顯示大腦外側裂或基底池存在滲出物，腦回增強或腦積水；在腦膜炎病變基礎上，在腦脊液中檢測到結核分枝桿菌，或者在肺結核基礎疾病上，同時腦脊液檢測：蛋白定量升高，氯化物、葡萄糖水平降低；皮膚結核菌素試驗顯示陽性。(2)惡性腫瘤、寄生蟲、細菌、真菌等細胞學檢查，均為陰性。(3)抗結核治療有效。疑似患者標準：發病時間>5d，神志改變，腦脊液檢查：血漿葡萄糖與腦脊液比值>0.5，以淋巴細胞為主；顱腦CT或MRI檢查異常，眼底檢查異常，合并有其他部位的結核。滿足以上4項為疑似患者。非結核性腦膜炎標準：腦膜炎類型已診斷明確，包括化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、腦部腫瘤及腦外傷等。

1.3 方法

1.3.1 住院儀器與試劑：抗酸染色劑由北京世濟合力生物科技有限公司生產，熒光定量PCR試劑由賽默飛世爾科技公司生產，儀器為ABI-PCR擴增儀。

1.3.2 抗酸染色涂片法：留取2ml腦脊液，離心機以12 000r/min速度離心，時間為15min，留取沉渣進行涂片，抗酸染色鏡檢，操作步驟遵照《結核病細菌學檢驗規程》。

1.3.3 結核分枝桿菌培養法：采用液體培養法，細菌與營養物質充分接觸，利于結核分枝桿菌快速增長，以結核分枝桿菌培養陽性為標準。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 按照試劑盒操作流程處理腦脊液：留取腦脊液500μl、進行濃縮，取200μl濃縮液，震蕩混合均勻，離心機以12 000r/min離心速度離心，時間為3min，去除上清液；加入生理鹽水1ml，重懸沉淀，以12 000r/min離心速度再次離心，時間為3min，去除上清液，沉淀后備用。吸取50μl的核酸釋放劑，充分混合均勻。放置3～5min備用，吸取36μl PCR反應液、內標液1μl、酶結合物2μl及制備好的樣本液5μl。設置溫度為94℃進行預變性5min；然后設置溫度94℃持續15s，57℃持續30s，進行40個循環；結果判定標準：Ct值>39的樣本，內標檢測為陽性，結果判定為陰性；Ct值≤39，曲線為標準的S形，結果判定為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件包進行數據分析。陽性率比較采用χ2檢驗，MTB DNA水平比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3種檢驗方法檢測MTB陽性率比較 確診結核性腦膜炎組的熒光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培養陽性率均高于疑似結核性腦膜炎組，差異具有統計學意義(P<0.05)，熒光定量PCR檢測陽性率高于抗酸染色涂片及MTB培養，差異均具有統計學意義(P<0.05)；熒光定量PCR靈敏性為70.83%(34/48),特異性為70.83%(17/24)；抗酸染色涂片靈敏性為8.33%(4/48)，特異性為95.83%(23/24)；MTB培養靈敏性為16.67%(8/48)；特異性為87.50%(21/24)；熒光定量PCR與抗酸染色涂片法、結核分枝桿菌培養法比較，具有更高的靈敏性(P<0.05)。32例非結核性腦膜炎患者腦脊液不同檢測方法檢測均為陰性。見表1。

表1 3種檢驗方法檢測MTB陽性率比較

2.2 結核分枝桿菌DNA檢測 確診結核性腦膜炎組患者MTB DNA對數值為4.627±0.816，疑似結核性腦膜炎組患者MTB DNA對數值為4.354±0.928，組間差異無統計學意義(P>0.05)

3 討論

結核性腦膜炎是結核分枝桿菌感染引起的非化膿性炎癥，可導致腦膜、腦實質及腦血管等組織損傷[4]。結核性腦膜炎是最為常見的肺外結核類型之一，約占1%。該疾病發病兇險，死亡率高達30%左右，尤其是兒童患者[5]。因此，早期診斷、早期干預是治療的關鍵。結核性腦膜炎癥狀繁多，腦脊液實驗室檢查缺乏典型變化特征，病原學檢測和生化檢查敏感度和特異性低，在發病早期，影響疾病的診斷[6]。因此，尋找新的檢測方法以提高檢測的特異性和敏感性十分必要。

目前，細菌學檢測仍是結核性腦膜炎的診斷標準，實驗室檢測主要包括抗酸染色涂片及MTB培養法。抗酸染色涂片的特點為快速、費用低廉、易操作，但是其特異性、敏感度均較低[1]。目前，MTB培養法為結核診斷的金標準，該檢測方法特異性高，但是培養時間較長，需4～6周才能得到檢測結果，并且僅有活菌才有可能培養成活，往往影響結核的早期診斷[7]。熒光定量PCR技術在臨床上得到了廣泛的應用，其敏感度、特異度均較高，對病原體的檢測非常簡便。高麗等[8]學者研究顯示結核分枝桿菌T細胞斑點試驗具有更高的敏感度和特異性，但是研究提到該技術要求較高，并且檢測費用昂貴，尚處于推廣階段。結核分枝桿菌PCR在診斷方面的優勢仍無法被取代。

本文中，確診結核性腦膜炎組的熒光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培養陽性率高于疑似結核性腦膜炎組(P<0.05)，熒光定量PCR檢測陽性率高于抗酸染色涂片及MTB培養陽性率，且具有更高的靈敏性(P<0.05)。32例非結核性腦膜炎患者腦脊液不同檢測方法檢測均為陰性。確診結核性腦膜炎組與疑似結核性腦膜炎組在結核分枝桿菌DNA水平方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明熒光定量PCR對疑似和確診結核性腦膜炎檢測水平是一致的。本研究結果陽性率與劉喆等[9]學者報道的53%～82%相一致，遠遠高于抗酸染色涂片和結核分枝桿菌培養等傳統方法。但是仍然存在29.17%的假陰性患者，分析原因，可能與以下因素相關：(1)部分結核性腦膜炎患者已經在他院經過抗結核治療，入院后檢測可能影響陽性檢出率。(2)結核分枝桿菌DNA拷貝數偏低。在炎癥早期，未達到檢測試劑下限。結核分枝桿菌DNA拷貝量的檢測下限為4.14×103，腦脊液MTB DNA拷貝數為低于檢測下限，表明疾病處于早期階段，或者由于血腦屏障的作用，影響熒光定量PCR的檢測結果。因此，對于疑似結核性腦膜炎患者應及時復查MTB DNA，以明確診斷，提高結核分枝桿菌檢測的陽性率[10]。

熒光定量PCR檢測雖然不能替代傳統檢測方法，但是該檢測技術較為成熟，已經在臨床上廣泛應用，且敏感性和特異性均較高。對于結核性腦膜炎的早期診斷，尤其是對一些傳統檢測方法及臨床癥狀不典型的病例，其檢測結果具有重要的參考價值。因此，對于存在有結核性腦膜炎臨床癥狀的患者，應當早期連續進行熒光定量PCR檢測。