子宮內膜基質細胞AQP7的表達以及卵巢激素對AQP7的調控作用#

劉敏 米永杰 劉洪 陳登榜 代呂霞 代娟 李飛燕 何煦 張丹

（1. 成都醫學院臨床醫學國家級實驗教學示范中心，四川 成都 610500；2. 成都醫學院檢驗醫學院，四川 成都 610500；3. 成都中醫藥大學醫學與生命科學學院影像教研室，四川 成都 610016.）

據報道，全世界大約75%的早期妊娠失敗源于胚胎植入的異常[1,2]。盡管體外受精和胚胎移植技術在治療不孕不育有較大進展，但是胚胎植入率仍然不理想[3]。

研究胚胎早期發育和胚胎著床有助于解決這一難題。然而對于人類胚胎著床研究由于受到倫理的限制，因而該領域的研究主要在實驗動物模型，特別是小鼠中進行。小鼠囊胚黏附于子宮內膜上皮后，圍繞囊胚周圍的基質細胞快速增殖與分化，從而促使囊胚完全植入子宮內膜，該過程稱為蛻膜化，蛻膜化是早期妊娠的重要過程[4,5]。

分布于細胞膜的水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一種六次跨膜蛋白，AQPs通過介導水轉運來維持內環境的平衡。在已發現的16種AQPs (AQP0-AQP14,16) 中，第二類為甘油水通道蛋白，這類AQPs可以介導甘油等的跨膜轉運[6]，AQP7屬于甘油水通道蛋白。

研究發現，在腸上皮和皮膚腫瘤的發生等細胞增殖速度快的組織中，甘油水通道蛋白跨膜轉運的甘油通過代謝為這些組織提供細胞增殖所需要的能量[7,8]。而子宮內膜蛻膜化過程與腫瘤局部能量代謝相似，子宮蛻膜細胞的增殖和分化需要大量的能量供應，因此我們推測AQP7參與了小鼠子宮蛻膜化的發生。

我們采用孕小鼠模型，分離原代小鼠子宮內膜基質細胞建立體外蛻膜化模型，研究AQP7在小鼠子宮內膜中的表達情況，AQP7在體外誘導蛻膜化模型中的表達，以及卵巢激素對AQP7的調節作用，以探討AQP7在子宮基質細胞蛻膜化中的作用。

1 材料與方法

1.1 構建孕小鼠模型

實驗所用ICR小鼠（7～9周周齡）均購于成都達碩實驗動物股份有限公司。雌性與雄性小鼠按2：1比例合籠。本研究通過成都醫學院醫學倫理委員會批準，操作符合關于善待實驗動物指導性意見的要求。

1.2 小鼠原代子宮內膜基質細胞（ESCs）分離培養及體外誘導蛻膜化模型的建立

將25 g·L-1的胰酶和6g/l的分散酶加入至孕小鼠子宮組織塊中，置4℃孵育60 min，室溫30 min；使用含1%胎牛血清的D-Hank’s 液終止消化，收集沉降組織。加入0.05%的膠原酶I消化組織塊，37℃孵育20 min；在沉積組織中加入PBS 液，收集上清液，1500 rpm離心5分鐘，沉淀即為基質細胞。

基質細胞用DMEM/F12培養基重懸，在37℃、5% CO2培養箱中培養；細胞貼壁后，加入10-6M 醋酸甲羥孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以體外誘導基質細胞蛻膜化。

1.3 采用RT-qPCR 檢測子宮內膜蛻膜細胞中AQP7、 prl8a2的mRNA表達

使用Trizol試劑提取細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒中的實驗步驟構建逆轉錄體系，獲得cDNA產物；擴增反應在熒光定量PCR 儀（型號PIKORed 96，ThermoFisher儀器有限公司，美國）上進行，反應結束后，采用MUS β-actin作為內參基因，利用SDS軟件進行數據分析。

所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE純化：AQP7 上游引物5'-3' GCTTGGTCTGCTGCTTCAG，下游引物5'-3' GGGGTTCGAGTGATGCATTT；Prl8a2 上游引物 5'-3' AGCCAGAAATCACTGCCACT，下游引物5'-3' TGATCCATGCACCCATAAAA；MUSβ-actin 上游引物5'-3' TCAGGAGGAGCAATGATCTTG，下游引物5'-3' TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA。

1.4 免疫組織化學染色

收集孕小鼠子宮，石蠟包埋切片，將脫蠟后的切片加入3%雙氧水置室溫10min，PBS洗3次；高溫抗原修復切片后冷卻至室溫，滴加山羊血清以封閉非特異性結合位點；滴加一抗（兔抗小鼠AQP7多克隆抗體1:200，Proteintech，美國），4℃過夜；滴加生物素化二抗IgG工作液，37℃ 30 min；二氨基聯苯氨液染色后采用蘇木素輕度復染，顯微鏡下觀察AQP7在子宮內膜的分布特點。

1.5 細胞體外激素處理

將體外培養的子宮基質細胞進行分組，分別加入含有雌二醇 E2（10 nM），孕酮P4（1μM）以及E2（10n M）和P4（1μM）的DMEM/F12 培養基，處理24小時后收集細胞。

用E2的拮抗劑ICI 182,780（1μM）和 P4的拮抗劑RU486（1μM）預處理基質細胞2小時后，再用E2和P4處理24小時后收集細胞進行檢測。

1.6 統計學分析

實驗樣品均一式三份，每項實驗至少重復檢測三次。實驗數據用均值±標準差表示。采用SPSS20.0軟件分析數據。采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，在比較兩個以上樣本間時，以單因素方差分析組間差異。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AQP7在小鼠子宮內膜基質細胞中表達具有明顯的時空特點

體外分離孕4～8天小鼠子宮基質細胞，采用RT-PCR檢測基質細胞AQP7 mRNA的表達情況。檢測結果如圖1A所示，AQP7 mRNA在孕4～8天的子宮內膜基質細胞中的表達逐漸升高。

收集孕4～8天小鼠子宮，采用免疫組化染色檢測AQP7蛋白在子宮內膜組織的表達，結果（圖1B、圖1C）顯示，在孕第4天的著床窗口時期，子宮內膜基質細胞幾乎不表達AQP7。

圖1 AQP7在孕早期小鼠子宮內膜上皮的表達

隨著孕激素分泌增加，在孕第5天，AQP7主要表達于子宮內膜著床胚胎周圍的初級蛻膜區（PDZ）基質細胞中。在孕第6天和孕第7天，隨著孕激素進一步分泌和基質細胞蛻膜化進程，子宮內膜蛻膜化的基質細胞中AQP7的表達明顯增多，免疫組化染色呈強陽性。

而孕第8天，子宮內膜次級蛻膜區SDZ蛻膜細胞中，AQP7的表達有所減弱。從孕第5天到第8天，隨著蛻膜化的進程，子宮內膜基質細胞中AQP7表達模式表明雌、孕激素可以調節AQP7蛋白的表達。

2.2 在體外誘導蛻膜化模型中AQP7在蛻膜細胞中的表達

分別于0 h、48 h、72 h和96 h，在體外分離培養的小鼠基質細胞中加入10-6M 醋酸甲羥孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以誘導基質細胞蛻膜化，以建立體外誘導蛻膜化模型。

通過RT-PCR檢測小鼠蛻膜標記物Prl8a2 mRNA在基質細胞中的表達、以判斷基質細胞蛻膜化的情況。

研究結果發現，在誘導蛻膜化后72 h和96 h小鼠基質細胞中Prl8a2 mRNA表達顯著升高，以96 h時基質細胞中Prl8a2 mRNA升高尤為明顯（圖2A），提示體外誘導蛻膜化模型建立。

隨后采用RT-PCR檢測在誘導蛻膜化不同時間點、基質細胞中AQP7 mRNA的表達情況，結果發現，在誘導蛻膜化后72 h和96h小鼠基質細胞中AQP7 mRNA表達顯著升高，以96 h時基質細胞中AQP7 mRNA升高尤為顯著（圖2B）。

圖2 體外誘導蛻膜化模型中蛻膜細胞AQP7的表達

2.3 卵巢E2和P4上調基質細胞AQP7表達

將分離側小鼠孕5天的基質細胞進行體外培養，待細胞貼壁后分為：① E2組，分別在6小時、12小時和24小時加入0.01μmol?L-1E2； ② P4組，分別在6小時、12小時和24小時加入1 μmol?L-1P4； ③E2和P4聯合處理組，分別在6小時、12小時和24小時加入0.01μmol?L-1E2和1μmol?L-1P4。④用ER拮抗劑ICI 182,780（1 μM）和PR拮抗劑RU486（1 μM）預處理基質細胞 2 小時后，再用E2和P4處理24小時。在不同時間點收集細胞，RT-PCR檢測卵巢激素對基質細胞AQP7的調控。結果發現，與對照組比較，E2組在不同的時間點、單獨加入E2后基質細胞AQP7表達無明顯變化（圖3A）。而P4組在不同的時間點、單獨加入P4后，基質細胞AQP7表達也無明顯變化（圖3B）。而與對照組比較，E2+P4組在E2和P4聯合作用6小時基質細胞AQP7表達無明顯改變，作用12小時后基質細胞AQP7表達開始升高（圖3C），作用24小時后基質細胞AQP7表達進一步顯著升高（圖3C），這表明E2和4P聯合作用可上調基質細胞AQP7表達；且在E2和P4聯合作用24小時后，基質細胞AQP7表達的升高能夠被拮抗劑ICI 182,780和拮抗劑RU486阻斷（圖3D）。

圖3 體外激素模型中卵巢激素對基質細胞AQP表達的調控

3 討論

水通道蛋白（AQPs）是跨膜通道蛋白。到目前為止，至少發現12種AQPs在哺乳動物的不同組織中有表達[9,10]。有關AQP7在子宮中的表達也有報道[11]。在體外培養的小鼠子宮內膜上皮細胞中檢測發現AQP7的表達顯著升高。Tanski D等研究中發現AQP7在豬的子宮內膜腔上皮細胞中顯著升高[12]。彭在對孕小鼠進行檢測時，發現AQP7在子宮蛻膜組織中的表達顯著升高[13]。AQP7屬于甘油水通道蛋白中，甘油水通道蛋白可以介導甘油轉運，甘油被證明是細胞增殖的替代能源，特別是在高代謝的組織中更為明顯[14]，這在哺乳動物的生殖過程中起到了關鍵的作用[6]。

我們在研究中發現，孕早期小鼠子宮基質細胞AQP7呈高表達，主要表達于子宮內膜初級蛻膜區和次級蛻膜區。這些結果與彭的研究一致[13]。并且我們發現AQP7的表達模式與蛻膜化進程密切相關，隨著蛻膜化的發展，AQP7的表達越顯著，表達范圍也更加廣泛，這表明雌、孕激素可以調節AQP7蛋白的表達。

AQP7在小鼠圍繞胚胎著床部位的蛻膜細胞中高表達的模式表明其在蛻膜化和胚胎著床中發揮了重要作用。隨后，我們分離小鼠子宮內膜原代基質細胞建立了體外誘導蛻膜化模型。在體外誘導的蛻膜細胞中AQP7同樣特異性地高表達。彭等進一步研究發現在圍植入期，子宮中甘油含量和甘油激酶表達也隨蛻膜化進程逐漸增加[13]。AQP7表達與子宮中甘油積累、甘油激酶表達協同增高的特異表達，因而認為甘油可能是小鼠子宮蛻膜化過程中必要的能量物質，AQP7很可能通過介導甘油轉運而參與基質細胞向蛻膜細胞的轉化[13]。

為進一步探究雌、孕激素對子宮基質細胞AQP7表達的影響，我們在體外培養的孕小鼠的基質細胞中加入E2和P4，采用 RT-PCR檢測卵巢激素對基質細胞AQP7的調控。結果發現，單獨加入E2以及P4后、基質細胞AQP7表達無明顯變化，表明雌激素和孕激素單獨作用對基質細胞AQP7表達無明顯調控作用。而E2和P4聯合組在E2和P4聯合作用后，基質細胞AQP7表達顯著升高，這表明E2和P4激素的聯合作用可上調基質細胞AQP7的表達。并且我們進一步研究發現，E2和P4聯合調控的基質細胞AQP7的升高能夠被雌激素受體的拮抗劑ICI182,780和孕激素受體的拮抗劑RU486阻斷，這提示雌二醇和孕酮可以通過其類固醇激素受體調控AQP7的表達。AQPs的表達可能受到各種調控因素的影響，除了雌、孕激素外，還可能受到細胞因子、激活信號等的作用。 Tanski, D等分離豬的子宮內膜腔上皮細胞并體外培養，結果發現E2 聯合 H89（PKA抑制劑）、E2 聯合 PD98059（MAPK抑制劑）、P4聯合PD98059可以促使內膜腔上皮細胞AQP7的表達增加[12]。這表明在排卵期，豬的子宮內膜上皮細胞AQP7的表達可能由雌二醇、孕酮通過PKA信號或者MAPK信號途徑調控，然而調控AQP7表達的機制還不清楚。

隨著蛻膜化的進程，在孕早期小鼠子宮內膜基質細胞AQP7表達逐漸增加。在體外誘導的蛻膜細胞中AQP7同樣特異性地高表達。卵巢雌二醇和孕酮聯合作用可上調子宮基質細胞AQP7表達。AQP7在小鼠圍繞胚胎著床部位蛻膜細胞的高表達模式，表明其在蛻膜化和孕早期胚胎著床中發揮著重要作用。而AQP7在蛻膜化中作用機制尚不清楚，需要在后續的實驗中進一步地探索。