草魚源乳酸菌的分離鑒定及其生物學特性研究

王 楠 ，尹紀元，王英英，李瑩瑩，吳斯宇，石存斌，李家豪，曹際振，王 慶

（1. 上海海洋大學/水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 2. 中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業農村部漁藥創制重點實驗室/廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380）

水產養殖業是我國農業經濟的重要組成部分[1]。2019年我國漁業生產總值高達12 934.49億元，草魚作為最重要的淡水養殖品種之一，約占我國淡水魚總產量的20%[2]。草魚呼腸孤病毒 (Grass carp reovirus, GCRV) 引起的草魚出血病 (Grass carp hemorrhagic disease, GCHD)[3]和嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)、維氏氣單胞菌 (A. veronii) 等導致的細菌性敗血癥[4]是目前草魚養殖的主要病害，給我國草魚養殖業帶來了巨大的經濟損失[5]。疫苗雖能有效控制水產病害發生，且具有安全無污染的優點[6-7]，但草魚用疫苗卻只有草魚出血病滅活疫苗[8]和嗜水氣單胞菌敗血癥疫苗[9]。由于嗜水氣單胞菌血清型復雜，疫苗免疫不能完全解決草魚細菌性病害的防控問題[10]。抗生素和化學藥物的使用短期有效，但是水產品藥物殘留和病原菌耐藥性問題日益嚴重[11-12]。在水產病害防控過程中獲得確保水產品質量安全、環境友好且操作簡便、易于應用的綠色漁藥，是促進我國水產養殖健康發展的當務之急。

乳酸菌等益生菌是一類存在于動物黏膜系統中的共生細菌[13]，對酸堿膽鹽具有一定的耐受性，能夠很好地適應動物胃腸道環境[14]。該菌還能夠分解乳糖等多糖，提高飼料利用率[15]，改善水質[16]；其代謝產生的乳酸、細菌素等物質具有維持機體腸道功能和微生態平衡[17]、抑制病原微生物生長[18]、提高魚體特異性和非特異性免疫[19]等作用，因此乳酸菌具有通過生態防控減少水產病害發生，減少或替代抗生素和化學藥品在水產養殖中使用的潛質[20]。

為了獲得魚源益生菌，本研究從健康草魚黏膜系統分離乳酸菌，進行形態學觀察和種屬鑒定，對其理化特性、益生能力進行評價，以期為水產養殖病害生態防控制劑的研究和應用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

維氏氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌 (A. schubertii)、嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila)、遲緩愛德華氏菌 (Edwardsiella tarda)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 等病原菌由中國水產科學研究院珠江水產研究所水產病害與免疫研究室分離保存，乳酸乳球菌NZ9000 (L. lactis NZ9000)、植物乳桿菌標準株ATCC8014 (L. plantarum ATCC8014) 購自廣州勤卓生物科技有限公司。MRS肉湯培養基購于北京陸橋技術有限責任公司。過氧化氫 (H2O2)溶液、微生物生化鑒定管等生化試劑均購于廣東環凱微生物科技公司。商品乳酸菌購于泉州譽邦商貿有限公司。

1.2 草魚源乳酸菌的分離純化

將健康草魚處死后剪取腸道中段，用滅菌PBS溶液除凈腸內容物后剪碎腸組織進行組織勻漿。取適量勻漿液用滅菌PBS溶液倍比稀釋后涂布于MRS固體培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養。挑取菌落呈白色、邊緣光滑、中間隆起的小菌落接種在MRS液體培養基中擴大培養后劃線培養，重復3次以上，直至菌落形態完全一致。

1.3 分離菌株形態學觀察

1.3.1 菌體形態觀察 取對數生長期的菌液于載玻片上酒精燈固定，以結晶紫初染1 min，水洗，碘液媒染1 min，水洗，95%乙醇脫色20～30 s，水洗，番紅復染1 min，水洗。置于顯微鏡下觀察分離菌株染色情況和菌體形態。

1.3.2 菌落形態觀察 將分離菌株在無抗MRS固體培養基上三區劃線，置于30 ℃恒溫培養箱中靜置培養，觀察菌落顏色、大小、邊緣整齊度等特性。

1.4 種屬鑒定試驗

1.4.1 初步鑒定 將活化的分離菌株3 000 r·min-1離心5 min后盡棄上清，加入3% H2O2溶液，觀察是否有氣泡產生；挑取菌體至氧化酶試紙表面，觀察菌體顏色變化；取0.05 mL菌液接種于硝酸鹽還原生化反應管中30 ℃恒溫培養24 h后，依次滴加硝酸鹽還原甲液、乙液，觀察顏色變化。

1.4.2 生化反應分析 將活化的分離菌株在30 ℃培養箱中培養24 h，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]，確定其生化反應特征。

1.4.3 16S rRNA 鑒定 按照天根基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離乳酸菌基因組DNA，以16S rRNA通用引物 (27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGCTACCTTGT-TACGACTT-3') 進行PCR擴增。PCR反應條件為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸2 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后測序分析[22]。

1.5 生長曲線測定

將活化的乳酸菌分離株稀釋至相同濃度，按3%比例接種至MRS肉湯中，37 ℃培養并持續測定菌液濃度至生長平臺期，繪制分離菌株的生長曲線。選擇分離乳酸菌中發酵性能最好的菌株進行后續評價。

1.6 環境耐受性評價

1.6.1 溫度耐受性評價 將分離乳酸菌Y190430按1%接種于MRS肉湯培養基中，分別于20、25、30、37、42 和45 ℃培養，測量分離菌株在不同溫度條件下的生長速率。

1.6.2 酸堿耐受性評價 將分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014及商品乳酸菌菌液培養至光密度 (OD600) 為 0.08～0.10，以1%分別接種于pH 為 2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0、8.5和9.0的MRS肉湯培養基中，最適溫度條件下靜置培養并繪制生長曲線。

1.6.3 滲透壓耐受性評價 將分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014及商品乳酸菌菌液培養至OD600為 0.08～0.10，以1%分別接種在NaCl質量分數為0.9%、2%、4%、6%和8%的MRS肉湯培養基中，最適溫度條件下靜置培養并繪制生長曲線。

1.7 抗生素敏感性試驗

采用藥敏紙片法分析分離的乳酸菌抗生素敏感性。吸取200 μL 37 ℃靜置培養12 h，OD600為2.50的分離株菌液涂布于MRS固體培養基上，待干后，分別將青霉素、氨芐西林、多西環素、四環素、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素和林可霉素的抗生素紙片貼在培養基表面，每組設置4個重復。37 ℃靜置培養過夜，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.8 益生效果評價

1.8.1 產酸性能測定 將活化的乳酸菌分離株稀釋至相同濃度，按3%比例接種至MRS肉湯中37 ℃培養，持續監測菌液pH變化，并繪制乳酸菌產酸速率曲線，同時與植物乳桿菌標準株ATCC8014、商品乳酸菌的產酸性能進行比較。

1.8.2 抑菌能力分析 采用打孔平板對峙法[23]測定分離菌Y190430對草魚常見病原菌的拮抗活性，以維氏氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌、乳酸乳球菌NZ9000作為指示菌，以植物乳桿菌標準株ATCC8014株和商品乳酸菌作為參考，分別吸取200 μL病原菌菌液均勻涂布到MRS平板上，再用無菌打孔器 (直徑6 mm) 均勻打3個孔，每個瓊脂孔添加60 μL乳酸菌，每組設置3個重復，生理鹽水作為空白對照，置于37 ℃培養24 h，測量并記錄抑菌圈直徑，同時與植物乳桿菌標準株和商品乳酸菌的抑菌性能進行比較。

1.9 安全性試驗

將分離乳酸菌Y190430和植物乳桿菌標準株ATCC8014以生理鹽水稀釋至終濃度為1×109CFU·mL-1，將平均體質量為140.0 g的草魚隨機分成3組，每組20尾，試驗組每天灌胃分離菌200 μL·尾-1，連續灌胃21 d；對照組分別每天灌胃植物乳桿菌標準株和PBS 200 μL·尾-1，連續灌胃21 d，持續觀察各組草魚精神狀態和攝食量，并測量各組草魚體質量。

1.10 統計學分析

使用SPSS 23.0 統計軟件對重復測量數據進行One-way ANOVA方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 菌株的初步鑒定

通過反復劃線純化，從魚體腸道共分離純化得到8株分離菌株，依次編號為C13、C14、C15、C16、C17、C18、C20、C35，分離菌株在固體培養基中培養后菌落形態高度一致，菌落呈圓形、白色、表面光滑、邊緣整齊、不透明的小菌落 (圖1-a，表1)。革蘭氏染色結果為菌體呈短桿狀、兩端鈍圓、染色呈陽性 (圖1-b)。

表1 分離菌株的菌落形態特征Table 1 Colony morphological characteristics of isolated strains

圖1 分離菌株的菌落形態特征 (a) 及革蘭氏染色 (b)Figure 1 Colony morphological characteristics (a) and gram staining (b) of isolated strains

2.2 魚源乳酸菌的種屬鑒定

分離純化菌株的過氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原反應結果均為陰性，初步判定分離菌株為乳酸菌，并按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]中細菌生理生化指標對分離菌株進行生化鑒定 (表2)，鑒定結果表明8株分離乳酸菌均為植物乳桿菌。同時，通過16S rRNA PCR對分離菌株進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析結果表明離菌株均在1 500 bp位置有特異性擴增條帶 (圖2)。對PCR產物進行測序分析，16S rRNA測序比對結果表明8株分離菌與植物乳桿菌的相似性均為100%，系統發育樹見圖3。

圖2 分離菌株的16S rRNA序列的PCR擴增結果Figure 2 PCR amplification results of 16S rRNA sequence of isolated strainsM. DL2 000 Marker; 1. C13; 2. C14; 3. C15; 4. C16; 5. C17;6. C18; 7. C20; 8. C35.

圖3 基于分離菌株16S rRNA序列的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of isolated strains

表2 分離菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

2.3 生長曲線

通過生長曲線的測定對分離乳酸菌的發酵性能進行評價，結果見圖4。大約在接種后第2小時菌株進入對數生長期，在接種后第8小時進入平臺期，其中分離菌株C13具有較好的生長速率和最好的發酵濃度及發酵性能，到達平臺期的OD600約為2.257，暫命名為L. plantarum Y190430。

圖4 分離菌株的發酵生長曲線Figure 4 Fermentation growth curve of isolated strains

2.4 環境壓力耐受能力

2.4.1 溫度耐受性 將乳酸菌Y190430分別在20、25、30、37、42和45 ℃條件下進行培養，檢測分離乳酸菌不同溫度條件下的生長情況(圖5-a )結果表明分離菌株Y190430在不同溫度條件下均能生長。在37 ℃溫度條件下分離菌株Y190430生長速率較快，且平臺期的菌液濃度最大，OD600為2.257；在42 ℃條件下分離菌株Y190430能夠生長，發酵最高OD600為1.328；在45 ℃條件下分離菌株Y190430不再生長。

2.4.2 酸堿耐受性 將乳酸菌Y190430分別接種在不同pH培養基中，37 ℃條件下培養。分離乳酸菌Y190430能夠耐受的最小pH為3.0，最適生長pH為5.6，pH 2.0環境中分離菌株Y190430停止生長，環境pH高于7.0時分離菌株Y190430的生長速率降低，但是仍可生長(圖5-b)。分離株Y190430與標準株ATCC8014相比較，在pH為2.0、3.0、4.0時的生長速率差異顯著 (P＜0.01)；分離株Y190430與商品株相比較，在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0和9.0時的生長速率差異顯著 (P＜0.05，表3)，說明分離菌株Y190430具有更強的酸堿耐受性。

表3 分離菌株Y190430對酸堿的耐受性Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain ±SD

表3 分離菌株Y190430對酸堿的耐受性Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain ±SD

注：A. 植物乳桿菌Y190430與植物乳桿菌ATCC8014相比較具有顯著性差異；B. Y190340與商品株相比較具有顯著性差異。Note: A. Significant difference between L. plantarum Y190430 and L. plantarum ATCC8014; B. Significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus.

商品乳酸菌Commercial lactobacillus 2.0 2.50±0.08AB 1.10±0.03 1.70±0.05 3.0 3.50±0.05AB 2.90±0.02 3.20±0.05 4.0 7.30±0.04AB 5.90±0.04 7.00±0.07 5.0 8.30±0.02AB 8.10±0.07 8.10±0.07 5.6 8.90±0.24 8.80±0.02 8.80±0.07 6.0 8.80±0.04AB 8.50±0.04 8.60±0.07 7.0 8.50±0.02A 8.30±0.02 8.40±0.08 8.0 8.20±0.04B 8.10±0.07 8.00±0.07 9.0 8.00±0.04AB 7.50±0.02 7.70±0.02培養pH Incubation pH菌落總數 CFU/(logCFU·mL-1)植物乳桿菌Y190430 L. plantarum Y190430植物乳桿菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014

2.4.3 滲透壓耐受性 將乳酸菌Y190430分別接種在不同NaCl質量分數的MRS液體培養基中，37 ℃條件下培養。分離菌株Y190430對高滲環境具有一定耐受性，在8% NaCl培養環境中，雖然發酵能力減弱，但是仍可生長 (圖5-c)。在不同滲透壓條件下的適應性，分離株Y190430與標準株ATCC8014之間無顯著性差異 (P＞0.05)。在0.9%、2% NaCl培養環境中，分離株Y190430與商品株之間存在顯著性差異 (P＜0.05，表4)。

表4 分離菌株Y190430對滲透壓的耐受性Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain ±SD

表4 分離菌株Y190430對滲透壓的耐受性Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain ±SD

注：B表示植物乳桿菌Y190430與商品株相比具有顯著性差異(P＜0.05)。Note: B represents significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus (P＜0.05).

氯化鈉質量分數NaCl mass fraction/%菌落總數 CFU/(log CFU·mL-1)植物乳桿菌Y190430 L. plantarum Y190430植物乳桿菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014商品乳酸菌Commercial lactobacillus 0.9 8.90±0.08B 8.80±0.08 8.50±0.16 2.0 8.70±0.16B 8.50±0.16 7.90±0.16 4.0 7.10±0.16 6.90±0.08 6.90±0.16 6.0 6.50±0.08 6.70±0.16 6.40±0.16 8.0 5.10±0.24 5.00±0.16 4.70±0.20

圖5 分離菌株Y190430的環境耐受性分析結果a. 溫度耐受性；b. 酸堿耐受性；c. 滲透壓耐受性。Figure 5 Environmental tolerance analysis results of Y190430 straina. Temperature tolerance; b. Acid base tolerance;c. Osmotic pressure tolerance.

2.5 抗生素敏感性

用多種抗生素的微生物藥敏片對植物乳桿菌Y190430的抗生素敏感性進行評價。抑菌直徑與標準抑菌直徑比較結果表明，分離的植物乳桿菌對氨芐西林、多西環素、四環素、氟苯尼考、氯霉素、紅霉素和林可霉素等常見抗生素敏感；對青霉素較敏感 (表 5)。

2.6 益生性能評價

2.6.1 產酸性能 乳酸菌可以通過分泌乳酸等有機酸，調節環境pH、抑制病原微生物。因此乳酸菌的產酸能力可以間接評價其益生效果。測定分離菌株Y190430的產酸速率曲線，同時以植物乳桿菌標準菌株ATCC8014以及商品乳酸菌作為參考。接種后0 h分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014和商品菌株的pH均為5.85；接種后2 h分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014和商品菌株的pH分別為5.54、5.60、5.72；接種后8 h分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014和商品菌株的pH分別為4.07、4.20、4.52；分離菌株Y190430、標準菌株ATCC8014和商品菌株發酵液能夠達到的最小pH分別為3.55、3.56、3.80(圖6)。相較于標準株ATCC8014，分離菌株Y190430在接種后8～12 h，培養基pH值差異顯著(P＜0.05)，12 h后無顯著差異 (P＞0.05)；與商品株相比較，在接種2 h后，培養基pH差異極顯著 (P＜0.01)，表明分離株Y190430具有更高的產酸速率。2.6.2 抑菌能力 分離獲得的草魚源植物乳桿菌對水產養殖中的常見致病菌均具有一定抑制作用(表6)。與標準株ATCC8014相比較，分離株Y190430對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌效果更強，具有顯著性差異 (P＜0.05)。與商品株相比較，分離株Y190430對遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌效果更強，具有顯著性差異 (P＜0.05)。分離株Y190430對植物乳桿菌、乳酸乳球菌等益生菌不產生抑制作用。

圖6 分離株Y190430的產酸性能a. 與標準株相比較具有顯著性差異；b. 與商品株相比較具有顯著性差異；ab. 與標準株、商品株相比較均具有顯著性差異。Figure 6 Ability to produce acid of Y190430 straina. Compared with standard strain, there is a significant difference;b. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; ab. Compared with standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference.

2.7 安全性評價

安全性試驗中以分離菌株連續21 d口服灌胃草魚，試驗期間草魚無一死亡，相較于對照組，試驗組草魚攝食、游動未見異常。試驗期間，PBS對照組草魚平均體質量由141.3 g生長至147.0 g，標準株對照組草魚平均體質量由139.1 g生長至146.1 g，分離株試驗組草魚平均體質量由139.6 g生長至146.6 g。相較于兩組對照組，草魚體質量增重在試驗期間均無顯著差異 (P＞0.05)。結果表明口服分離菌株草魚安全性較好，對其生長未產生顯著影響。

3 討論

據《2020中國水生動物衛生狀況報告》，2019年我國養殖草魚因各種病害造成的測算經濟損失約25.8億元[24]，嚴重危害了我國草魚養殖業的健康發展。抗生素等藥物雖然有效但在使用時存在諸多問題[25-26]。乳酸菌等益生菌是健康魚類黏膜系統內天然共生的一類益生菌，可通過維持或調節宿主腸道微生物平衡，改善宿主健康和生長性能[27]，研究發現在虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[28]、凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)[29]和海參 (Apostichopus japonicus)[30]等水產動物的日糧中添加乳酸菌能促進生長、提高抗病力，并可以與腸道內有害菌產生競爭，確保腸道健康[31]。本研究從健康草魚腸黏膜系統中篩選獲得8株乳酸乳桿菌，經鑒定均為植物乳桿菌。植物乳桿菌在水產健康養殖中的應用早有報道，Man和Xiang[32]發現植物乳桿菌與其他乳酸菌相比較產酸性能更強，能更好地穩定微環境pH；其代謝產生的乳酸菌素是一種生物防腐劑，可以抑制池塘底部餌料和糞便腐爛，降低水體中氨氮和亞硝酸鹽含量；王水泉等[33]研究發現植物乳桿菌分解和利用植物多糖的能力更強，能夠更好地提高飼料利用率、凈化水質；劉佳琪等[34]構建表達IPNV VP2蛋白的重組虹鱒源植物乳桿菌，口服飼喂虹鱒后能夠顯著提高其抗感染能力。

發酵能力是評價生物工程菌的重要指標之一，快速增殖的乳酸菌在腸道環境中更容易獲得競爭優勢，與其他細菌競爭黏膜真皮層的黏附位點[35-36]和營養物質[37]，進而競爭性抑制微環境中的病原微生物[38]。本研究對8株分離乳酸菌生長曲線進行測定，結果顯示植物乳桿菌Y190430的生長速率較快，發酵濃度最高，具有作為生物工程菌的應用潛力。此外，由于環境中的pH、溫度和鹽度對細菌繁殖生長具有抑制作用，因此乳酸菌在消化道中的發酵效果也與菌株對pH、溫度和鹽度等環境因素的耐受能力有關。有研究表明有胃魚類的胃內pH最低能達2[39]，鯉科等無胃魚類的消化道內pH近中性[40]，本研究酸堿耐受試驗表明植物乳桿菌Y190430能夠耐受的環境最小pH為3.0，因此可以直接在無胃魚類健康養殖中進行應用，而在有胃魚類病害防控應用中則需要通過與殼聚糖等生物高分子混合，提高菌劑在胃內的成活率[41]。分離株Y190430的最適培養溫度為37 ℃，在20 ℃生長速率雖有所下降，但仍可正常生長；由于魚類為變溫動物，草魚等淡水魚類的最適養殖溫度為20～30 ℃[42]，本研究分離株在20 ℃條件下仍可保持較好的生長性能，因此適合在淡水養殖中應用。此外，在飼料加工和生物技術操作過程中常會在一定范圍內提高培養或加工溫度，本研究分離乳酸菌可以耐受42 ℃，對高溫環境具有一定耐受性，具有作為生物工程菌進行生物工程操作和改造的潛質。

乳酸菌是公認的益生菌，具有改善消化道微環境、提高宿主免疫力、抑制病原微生物等作用，研究表明乳酸菌廣泛分布在動物腸道中，維持消化道微生物群落穩定[43]、抑制腸道內致病菌的生長繁殖，與人類[44]和水產養殖動物[35]的健康密切相關。乳酸菌能通過產生乳酸[45]、細菌素、H2O2及小分子肽類等[46]代謝產物對腸道致病菌產生抑菌或殺菌作用，Cai 等[47]證實乳酸菌分泌產生的乳酸是其抑菌的重要物質基礎。本研究對植物乳桿菌Y190430的產酸性能進行評價，與植物乳桿菌標準株ATCC8014相比較，分離菌株Y190430具有更好的產酸速率。為了進一步評價分離乳酸菌對病原菌的抑制能力，及其對其他益生菌菌株的影響，本研究發現從健康草魚黏膜系統分離獲得的草魚源植物乳桿菌Y190430對嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等幾種能夠引起草魚發病的條件病原菌均有一定的抑制作用；對植物乳桿菌ATCC8014和乳酸乳球菌NZ9000無抑制作用。與植物乳桿菌標準株ATCC8014相比較，分離株Y190430對嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌作用更顯著，表明該菌株對能夠針對性抑制導致草魚病害的主要病原菌，具有作為草魚病害生態防控制劑的潛質。

益生菌的安全性是其能否在生產中應用的重要前提。益生菌使用不當會引起宿主出現病理變化，有研究表明枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 可引起斑節對蝦 (Penaeus monodon) 細菌性白斑綜合征[48]；蠟樣芽孢桿菌 (B. cereus) 可引起刺參“腐皮綜合征”和凡納濱對蝦白斑綜合征[49-50]。閆肅等[51]研究發現，部分乳酸菌具有溶血活性，也能夠對宿主產生一定傷害。為評價分離菌株Y190430的安全性，本研究將1×109CFU·mL-1分離乳酸菌Y190430菌液以200 μL·尾-1連續21 d口服灌胃草魚，試驗期間草魚無一死亡，與對照組相比較，試驗組草魚攝食、游動等行為無顯著異常，且生長速度更快，但與對照組相比無顯著性差異 (P＞0.05)。

抗菌藥物在保證人類和動物健康的同時，也帶來了嚴重的耐藥問題。水產養殖動物主要細菌性病原的耐藥現象普遍存在[52]。益生菌如果攜帶抗生素耐藥性基因，在使用過程中很可能通過轉化、轉座等方式轉移到環境微生物中，使環境中的病原微生物獲得抗生素耐藥性[53]，對人類健康和生態環境造成潛在威脅。恩諾沙星、氟苯尼考、多西環素和磺胺甲唑是目前用于水產養殖動物細菌性疾病防治的主要藥物[54]。乳酸菌可能涉及青霉素類[55]、氨基糖苷類[56]和四環素類[57]的耐藥基因及其耐藥基因可轉移的風險。本研究評價了分離菌株Y190430對氨芐西林等常見抗生素的敏感性，結果表明植物乳桿菌Y190430對氟苯尼考、恩諾沙星和多西環素等常見抗生素的敏感性佳，在應用中既能有效規避耐藥轉移對人和環境造成的潛在危害，又能為科學用藥提供指導意見。

4 結論

本研究從健康草魚消化道黏膜中分離獲得8株乳酸菌，經16S rRNA鑒定和生化反應鑒定此8株乳酸菌均為植物乳桿菌，通過比較生長速率，篩選獲得發酵性能最好的菌株Y190430。該分離菌株具有較好的環境耐受性和抗生素敏感性，具有作為生物工程菌開發和應用的潛質。此外該分離菌株還具有很好的產酸性能和常見水產病原微生物拮抗作用，可作為水產病害生態防控的候選菌株。后期將對分離菌株體內抑菌能力和抗病毒能力展開進一步研究，以期能夠更好地作為益生菌制劑應用于水產動物病害的生態防控。