牡蠣酶解產物對超負荷哺乳大鼠泌乳的影響

諶素華，秦小明, ，章超樺, ，曹文紅, ，鄭惠娜, ，林海生,

（1. 廣東海洋大學食品科技學院/國家貝類加工技術研發分中心 (湛江)/廣東省水產品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2. 大連工業大學/海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目，俗稱海蠣子、蠔等，是世界第一大養殖貝類[1]。牡蠣肉鮮味美、營養豐富，富含蛋白質，其氨基酸組成和品質優于人乳和牛乳，有“海底牛奶”之稱[2]。牡蠣具有獨特的食用、藥用價值，是我國首批被列為藥食同源的保健食品之一[3]。據《神龍本草經》和《傅青主女科》記載，蠣肉治虛損，療婦人氣血；治產后汗出煩躁，效果顯著。研究表明，牡蠣酶解產物 (Oyster enzymatic hydrolysate products,OEHP) 具有增強免疫力[4]、抗腫瘤[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、降血壓[8]、降血糖[9]和抗炎[10]等多種生物活性，但有關OEHP對泌乳的作用和機理等尚未見報道。

母乳含有豐富的免疫物質和活性生長因子，能全面滿足嬰兒生長、發育的需要，母乳喂養是全球公認的最佳喂養方式[11-13]。目前受職業女性增加、剖宮產率增高、母乳喂養知識缺乏、膳食營養不均衡、生活方式改變以及社會環境等因素的影響，產后缺乳癥逐年攀升，母乳喂養現狀堪憂[14-17]。基于牡蠣的藥食兩用價值，有必要對其促進泌乳作用進行深入研究。本研究先開展了牡蠣粉對哺乳期超負荷哺乳母鼠泌乳影響的預實驗，結果顯示牡蠣粉能顯著改善哺乳期母鼠泌乳，在此基礎上，采用大鼠超負荷哺乳模型探索了OEHP對母鼠泌乳的調節作用，以期為牡蠣資源的開發與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級健康SD大鼠 (49日齡未配種大鼠)，購于北京華阜康生物科技有限公司，動物生產許可號為SCXK [(京) 2019-0008]。其中，雌性60只，雄性30只，雌鼠體質量為180～200 g，雄鼠體質量為 200～250 g。

香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis) 購于湛江霞山東風水產品市場，新鮮開殼清洗干凈，勻漿后冷凍干燥超微粉碎過100目篩制得牡蠣粉(Oyster powder, OP) 備用。OEHP的制備采用常格[18]方法，加入動物蛋白水解酶 (1 000 U·g-1)，53 ℃酶解4 h后離心取上清液濃縮冷凍干燥，得OEHP備用。

動物蛋白水解酶 (酶活為18×104U·g-1，南寧龐博生物工程有限公司)；硼酸、無水碳酸鈉、無水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸鉀、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸、三氯乙酸、二甲苯 (分析純，廣東光華科技股份有限公司)；蘇木精伊紅染色劑(＞200 T)、水合氯醛、乙酸鋅、福林酚、牛血清蛋白 (97%純度)、PRL試劑盒 (廣州鼎國生物技術有限責任公司)。

1.2 主要儀器與設備

UX42OH電子天平、HC10002小動物電子秤、ATY1124電子天平 (日本島津公司)；RM2016石蠟切片機、KD-H烘片機、DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡 (德國Leica公司)；Varioskan Flash全自動酶標儀 (美國Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 一般營養成分測定 水分按照GB 5009.3—2010采用常壓干燥法測定；灰分按照GB 5009.4—2010采用高溫灼燒法測定；脂肪按照GB 5009.6—2003采用索氏抽提法測定；蛋白質按照GB 5009.5—2010采用凱氏定氮法測定，轉換系數為6.25；總糖采用蒽酮比色法測定，測得標準曲線為y=0.005 9x+0.000 6 (R2=0.998 6)。

1.3.2 牡蠣粉和OEHP的灌胃量確定 參考胡培麗等[19]的方法，開展牡蠣粉對哺乳期母鼠泌乳的預實驗，灌胃劑量參考1 800 mg·kg-1；結合牡蠣酶解粉蛋白質含量及動物實驗實際情況確定本實驗的灌胃劑量，按照1∶2∶4選擇高、中、低劑量，確定OEHP的灌胃高、中、低劑量為1 250、625、312.5 mg·kg-1。

1.3.3 大鼠同籠交配 雌雄比2∶1，連續同籠7 d，交配后的雌鼠合籠飼養，每籠5只。妊娠20 d后，將雌孕鼠單籠飼養，做好分娩準備，每日觀察2次，及時了解大鼠分娩及分娩的胎仔數量，分娩結束后，清點仔鼠數。

1.3.4 超負荷哺乳模型建立 參考胡培麗等[19]和汪琴等[20]的方法，建立大鼠超負荷哺乳模型，取產仔前后相差不超過24 h的40只母鼠作為研究對象，每窩仔鼠調整為14只。在哺乳期前5 d一旦發現仔鼠死亡，記為仔鼠自然死亡，立即補充仔鼠到14只；超過5 d后仔鼠死亡，則不再補充異窩仔鼠。將母鼠按體質量隨機分為對照組和OEHP高、中、低劑量組，每組10只。自分娩第二日起，對照組每日以蒸餾水灌胃，給藥組分別以不同濃度的OEHP灌胃，每日1次，各組均灌胃21 d，各組動物均正常飲水。哺乳母鼠和仔鼠每天稱體質量1次，分別計算期間哺乳母鼠泌乳量和仔鼠平均體增重。每日觀察仔鼠死亡情況。

1.3.5 相關指標測定 1) 母鼠泌乳量測定。母鼠產仔后第二日起，每日08:00時將仔鼠與母鼠分離，待仔鼠饑餓4 h后，即12:00時對仔鼠進行哺乳前稱量，之后將仔鼠放回鼠窩中哺乳1 h，然后再次分離仔鼠與母鼠，并對哺乳1 h后的仔鼠進行稱量，仔鼠哺乳1 h前后的體質量差值即為這一小時的泌乳量。2) 仔鼠平均體增重測定。仔鼠從產后第二日起，每日08:00時將仔鼠與母鼠分離后立即稱量每窩仔鼠體質量，持續稱量21 d，記錄數據，計算21 d仔鼠前后體質量差。3) 乳腺器官指數、臟器指數測定。處死母鼠后剪取第三對乳腺稱質量；分別剪取母鼠心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟等稱質量并計算。乳腺指數=乳腺組織質量/母鼠體質量×100%，臟器指數=臟器組織質量/母鼠體質量×100%。4) 泌乳素 (Prolactin, PRL) 測定。PRL測定方法按試劑盒說明操作，酶標儀檢測，以標準物濃度為橫坐標，標準物的OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算出直線回歸方程，再將樣品的OD值代入直線回歸方程中，計算樣品濃度，即為母鼠血清PRL濃度，測得標準曲線為y=0.001 6x-0.032 2(R2=0.998 2)。5) HE染色法觀察乳腺組織結構。實驗結束時處死母鼠，剪取第三對乳腺，固定后染色鏡檢進行組織病理學觀察。

1.4 數據統計分析

所有實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統計和分析，利用獨立性t檢驗進行差異顯著性分析，結果均以“平均值±標準誤”表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 一般營養成分測定

牡蠣粉和OEHP一般營養成分測定結果見表1，兩者的蛋白質質量分數最高，其次是總糖，而脂肪質量分數較低。

表1 牡蠣及其酶解產物一般營養成分 (干基)Table 1 General nutrition indices and enzymatic hydrolysate products of oyster (dry mass basis) %

2.2 OEHP對超負荷哺乳母鼠泌乳量的影響

對超負荷哺乳大鼠持續灌胃21 d的每天每小時泌乳量和總平均泌乳量進行分析，結果見表2和表3。與對照組比較，OEHP高劑量組母鼠的每天每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的天數是第3、第4、第5、第6、第10、第11、第14、第15和第18天，有極顯著差異 (P＜0.01) 的天數是第1、第2、第7、第9、第12、第13、第16、第17、第20和第21天；中劑量組母鼠的每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的是第2、第3、第4、第11和第16天，有極顯著差異 (P＜0.01) 的天數是第9、第12、第13、第14、第18、第20和第21天；僅第8和第19天各劑量組母鼠每小時泌乳量無顯著差異；低劑量組母鼠每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的是第3、第16和第18天。與中劑量組相比，高劑量組母鼠每小時泌乳量在第6和第10天有顯著性差異 (P＜0.05)，在第1和第17天有極顯著差異 (P＜0.01)；與低劑量組相比，高劑量組在第5、第6、第7、第12和第16天有顯著差異 (P＜0.05)，在第1、第2、第9、第13、第17和第21天有極顯著差異 (P＜0.01)；與低劑量組相比，中劑量組在第5、第12和第14天有顯著性差異 (P＜0.05)，在第20天有極顯著差異 (P＜0.01)。本結果表明，OEHP高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量，中劑量組的影響次之，低劑量組的影響最小且效果不顯著，OEHP對超負荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關。

表2 母鼠哺乳21 d每天每小時泌乳量Table 2 Maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g·h-1

對灌胃21 d的各組母鼠總平均泌乳量進行分析，結果見表3。與對照組相比，OEHP高劑量組差異極顯著 (P＜0.01)，泌乳量增加57.85%；中劑量組差異顯著 (P＜0.05)，泌乳量增加38.02%；低劑量組差異不顯著，但泌乳量增加17.69%。以上結果表明OEHP使超負荷哺乳母鼠泌乳量顯著增加，可有效促進超負荷哺乳母鼠泌乳。

表3 母鼠哺乳21 d每小時泌乳量總平均值Table 3 Total average maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g

2.3 OEHP對哺乳期仔鼠體增重的影響

本實驗對哺乳21 d的仔鼠進行觀察記錄，未發現死亡現象。并對其體增重進行分析 (表4)。母鼠哺乳21 d后，OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對照組相比均有增加，分別增長13.62%、12.28%、11.99%，且差異極顯著 (P＜0.01)，高劑量組與中低劑量組相比有顯著差異 (P＜0.05)。本結果表明OEHP能明顯增加超負荷哺乳母鼠的泌乳量，從而使其窩仔鼠的體增重顯著增加，這一評價指標也表明OEHP對哺乳期母鼠有促進泌乳作用，可減少仔鼠的死亡。

表4 21 d仔鼠體增重Table 4 Total average body weight gain of newborn rats in 21 d g

2.4 OEHP對超負荷哺乳母鼠乳腺器官指數和臟器指數的影響

對灌胃21 d母鼠的乳腺器官指數和臟器指數進行分析，結果見表5和表6。OEHP高劑量組的乳腺器官指數與對照組差異極顯著 (P＜0.01)，中劑量組與低劑量組差異顯著 (P＜0.05)。本結果顯示各組乳腺器官指數由大到小的順序為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組＞對照組。乳腺器官指數能從側面反映哺乳期母鼠乳腺的生長、發育與泌乳情況，說明OEHP可以促進超負荷哺乳母鼠乳腺發育。

表5 母鼠乳腺器官指數Table 5 Mammary gland organ indexes of female rats

與對照組相比，灌胃OEHP各劑量組的母鼠心臟指數有顯著差異 (P＜0.05)，其中高劑量組差異極顯著 (P＜0.01)，說明OEHP能促進哺乳期母鼠的心臟發育，使其泵血更有力，從而增強哺乳期母鼠的負荷能力 (表6)。高劑量組母鼠的脾臟指數與對照組相比差異顯著 (P＜0.05)，且腎臟指數差異極顯著 (P＜0.01)。各組母鼠的臟器指數與對照組相比均有不同程度的增加，說明OEHP能增強超負荷哺乳母鼠的臟器負荷能力，有利于其哺育仔鼠。

表6 母鼠臟器器官指數Table 6 Organ indexes of female rats

2.5 OEHP對超負荷哺乳母鼠血清PRL濃度的影響

對灌胃21 d的各組哺乳母鼠的血清PRL進行分析，結果見表7。與對照組相比，高劑量組PRL質量濃度增加了41.67%，有極顯著性差異(P＜0.01)；中劑量組增加26.39%，有顯著性差異(P＜0.05)；低劑量組增加11.11%；OEHP高劑量組的PRL質量濃度比低劑量組高27.50%，有顯著差異 (P＜0.05)。由此可以得出OEHP高、中劑量組促進超負荷哺乳期母鼠泌乳的效果顯著，且存在一定的劑量依賴性。

表7 母鼠血清催乳素質量濃度Table 7 Serum PRL mass concentrations of female rats ng·mL-1

2.6 OEHP對超負荷哺乳母鼠乳腺組織結構的影響

對灌胃21 d各組母鼠的乳腺組織結構進行觀察，結果見圖1。與對照組相比，OEHP各劑量組的母鼠乳腺組織腺泡較多，且集中，泡腔充盈，導管數量多，導管腔較粗，腺泡有明顯擴大增生，OEHP高劑量組的效果最明顯，說明OEHP能促進超負荷哺乳母鼠乳腺發育，改善其乳腺結構，提高哺乳母鼠泌乳量，促進泌乳。

圖1 各組乳腺組織結構Figure 1 Tissue structure of mammary gland in each group

3 討論

大鼠泌乳調節方式同人類相似，在血漿PRL的調節下啟動和維持泌乳。在動物實驗中，雖然不易觀察正常哺乳的催乳作用，但能觀察到乳汁分泌不足情況[21]，所以在進行泌乳實驗時首先要建立乳汁不足的動物模型。常用的大鼠缺乳模型有2種：1) 用化學藥物處理大鼠，使母鼠缺乳，建立病理模型；2) 通過調整每只母鼠所哺育的仔鼠數量，使母鼠在哺乳一定數量的仔鼠時不能滿足仔鼠的哺乳需求，為超負荷大鼠模型。產后缺乳是指產后哺乳期內產婦乳汁甚少或無乳可下，不夠喂養嬰兒，乳房檢查松軟無痛，乳汁點滴而出[22]。為了能更好地貼合臨床實際，本研究采用正常大鼠超負荷哺乳模型來研究OEHP對母鼠泌乳的影響。

關于牡蠣促進泌乳的研究報道較少，有種含牡蠣粉的營養品和組合物能促進產婦泌乳和恢復[23-24]，其主要通過添加一定量的牡蠣營養品來促進泌乳作用，而有關牡蠣促進泌乳作用及其機制的研究未見報道。本文通過開展牡蠣粉對哺乳期超負荷哺乳母鼠泌乳的預實驗，確定牡蠣粉能有效改善超負荷母鼠泌乳，結合牡蠣粉在酶解后富含活性多肽且更容易被吸收利用的特點，對OEHP進行促進泌乳效果研究，為下一步對OEHP中促進泌乳的活性成分的研究奠定基礎。

乳腺是泌乳的前提，乳腺由乳腺組織和分布期間的結締組織構成[25]，其發育區別于機體其他組織器官，是哺乳動物出生后可繼續生長發育的動態變化的器官。泌乳過程以乳腺發育為基礎，發育完善的乳腺在PRL等作用下開始泌乳的發動和維持，而泌乳的每個階段受不同激素的影響，參與調節的主要激素包括PRL[26]、生長激素 (Growth homorne,GH)[27]、雌性激素[28]，在乳腺發育階段受雌激素和孕激素的影響，泌乳發動階段主要受PRL和糖皮質激素的影響，乳腺泌乳的維持階段受PRL和GH的調控[29]。乳汁的分泌過程首先是乳腺組織的分泌細胞從血液中吸取各種營養成分，隨后細胞利用這些養分合成乳汁，乳汁合成后分泌到腺泡中，最后經過導管等分泌到體外。腺泡可以理解為暫時儲存乳汁的空間[30]，所以腺泡腔體大小可反映泌乳能力，腺泡腔體越大，泌乳量越多。乳腺上皮細胞在PRL的作用下，其新陳代謝速度加快，乳蛋白mRNA濃度也相應增加[31]。王一飛等[32]通過研究發現“米酒雞”食療方可使產后缺乳母鼠的催乳素受體 (PRLR) 及β酪蛋白陽性表達增強，促進乳腺上皮細胞增殖和乳腺發育。張榮慶等[33]通過研究大豆黃酮對妊娠大鼠乳腺發育和泌乳作用的影響，發現大豆黃酮能夠顯著促進妊娠期大鼠乳腺的發育，明顯提高其泌乳量、血清GH和PRL濃度以及乳腺胞漿雌二醇受體數目。本實驗測定了哺乳母鼠血清PRL濃度，結果表明OEHP高、中劑量組能夠促進超負荷哺乳母鼠泌乳且效果顯著，但缺少對母鼠乳腺組織中PRL水平分析，后續實驗可通過增加此項來完善OEHP對超負荷哺乳母鼠泌乳效果及機制的研究。

4 結論

OEHP對超負荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關，高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量；OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對照組相比分別增加13.62%、12.28%、11.99%，且差異極顯著 (P＜0.01)，OEHP高劑量組與中、低劑量組相比，仔鼠體增重有顯著差異 (P＜0.05)；OEHP各劑量組母鼠乳腺指數與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)；OEHP高、中劑量組哺乳母鼠血清PRL水平與對照組相比差異顯著，且與灌胃劑量呈正相關。OEHP組與對照組的臟器指數相比均有不同程度增加，表明OEHP能夠增強哺乳期母鼠的臟器負荷能力，有利于其哺育仔鼠；在顯微鏡下觀察，OEHP組母鼠乳腺腺泡組織比對照組多且集中，泡腔充盈，導管數量多，導管腔較粗，腺泡有明顯擴大，表明OEHP能促進超負荷哺乳母鼠乳腺發育，改善其乳腺結構，提高哺乳母鼠泌乳量，促進泌乳。