響應面法優化枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸條件

摘 要：為探索枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸的最佳條件。以玉米秸稈與麩皮配比、尿素添加量、培養基初始pH為試驗因素，以發酵產物腐植酸含量為指標，根據單因素試驗結果選定因素水平，采用Box-Benhnken試驗設計法，研究各因素交互作用及其對發酵產腐植酸的影響，擬合獲得二次多項式回歸模型。結果表明：枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸的最佳條件為玉米秸稈與麩皮配比0.95∶1、尿素添加量0.81%、培養基初始pH 6.1，在37℃條件下發酵7 d，發酵產物腐植酸含量為19.58%，較優化前腐植酸含量提高了38.3%。

關鍵詞：腐植酸;玉米秸稈;枯草芽孢桿菌;響應面法;副產物綜合利用

中圖分類號：S 816.6 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）10-0047-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.010

Optimization of Humic Acid Production from Corn Straw Fermented byBacillus Subtilis Based on Response Surface Methodology

CHEN Yong-qiang

（Fujian Main Station of Agricultural Product Processing and Promotion， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to explore the best conditions for humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis， the proportion of corn straw and bran， the additive amount of urea and the initial pH of culture medium were taken as the experimental factors， and the content of humic acid was taken as the index. The factor levels were selected according to the results of single factor experiment， and the method of Box-Benhnken experimental design was used to study the interaction of various factors and their effects on humic acid， thus to obtain the quadratic polynomial regression model. The results showed that the optimal conditions of humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis were as follows： the proportion of corn straw and bran was 0.95∶1， the additive amount of urea was 0.81%， and the initial pH of culture medium was 6.1. After 7 days of fermentation at 37℃， the humic acid content of the fermentation products was 19.58%， which was 38.3% higher than that before the optimization.

Key words： Humic acid; Corn straw; Bacillus subtilis; Response surface methodology; Comprehensive utilization of by-products

玉米是我國重要糧食作物，每年產生大量玉米秸稈，如何提高這一農業廢棄物的綜合利用水平，減少環境污染和資源浪費，實現變廢為寶、化害為利，具有非常重要的意義[1-3]。利用農業廢棄物生產生物腐植酸是農業資源化和功能化的一個重要渠道，生物腐植酸活性比天然腐植酸高，作為一種生長調節劑，在種養殖等領域具有廣泛用途[4-9]。當前生物腐植酸的發酵方法仍以人工堆建自然發酵為主，存在產量低、產品質量不穩定等問題[10-12]。本研究對前期篩選獲得的具有腐植酸發酵能力的枯草芽孢桿菌進行發酵條件研究，以期為玉米秸稈的綜合利用探索渠道，為利用玉米秸稈生產腐植酸提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 原料與菌株

玉米秸稈、麩皮采自龍海市白水鎮，玉米秸稈烘干粉碎備用。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis從市售有機肥中篩選獲得。

1.2 試劑與培養基

菌種活化培養基與種子液培養基 [13]：牛肉膏 3 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH 7.0～7.2，121℃蒸汽滅菌20 min。種子液培養基不添加瓊脂。

基礎發酵培育基：玉米秸稈粉與麩皮重量1∶1，加水攪拌均勻，水分含量控制在75%左右，pH自然，121℃滅菌20 min。

試劑：重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、鄰菲羅啉、濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 主要儀器

BHC1300型超凈工作臺（蘇靜集團安泰公司），LRH型生化培養箱（上海一恒科技有限公司），THZ2氣浴式恒溫搖床（智城分析儀器制造有限公司），U2910型分光光度計（日本HITACHI公司），FZ102型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液制備 將菌種從斜面轉接到活化平板，37℃條件下生化培養箱培養24 h，然后轉接3環菌種到含100 mL種子培養基的 250 mL錐形瓶中，37℃、200 r·min-1搖床培養24 h，取培養液與滅菌生理鹽水混合，調節菌種液OD600在（1.0±0.1）作為發酵種子液。

1.4.2 發酵條件 500 mL錐形瓶裝發酵培養基100 g，接種5 mL種子液，混合均勻，37℃條件下生化培養箱發酵7 d，其間每隔2 d攪拌1次。本試驗內容均在此條件下發酵。

1.4.3 單因素試驗 （1）玉米秸稈與麩皮配比研究。調整基礎培養基玉米秸稈與麩皮比例，兩者重量比分別2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2，每個試驗做3個平行，進行發酵產腐植酸研究，探索較優主要發酵原料配比。（2）尿素添加量研究。在前期無機氮對發酵產腐植酸影響的研究中發現添加尿素有較好的促進作用，因此在基礎發酵培養中，以100 g玉米秸稈與麩皮基準，分別添加0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%尿素，每個試驗做3個平行，探討不同尿素添加量對發酵產腐殖酸的影響。（3）培養基初始pH研究。調節基礎發酵培養基初始pH分別為4、4.5、5、5.5、6，每個試驗做3個平行，探討不同初始pH對發酵產腐殖酸的影響。

1.4.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選取玉米秸稈與麩皮添加質量比（X1）、尿素添加量（X2）、培養基初始pH（X3）3個試驗因素的較優區域，以腐植酸含量為響應值，使用Designer-Expert 8.0.6 Trial軟件，進行三因素三水平Box-Benhnken Design（BBD）中心組合試驗設計[14]（試驗因素水平和編碼見表1），通過回歸分析優化枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸條件。

1.4.5 測定方法 采用重鉻酸鉀氧化法[15]測定發酵產物的腐植酸含量，以質量分數計，數值以%表示。試驗樣品發酵后60℃烘干2 h，經粉碎過篩后作為測定樣品;未接種的培養基同樣處理后作為空白樣品;結果計算不再扣除氯離子含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 玉米秸稈與麩皮配比對產腐植酸的影響 由圖1可知，發酵產物腐植酸含量隨著玉米秸稈與麩皮添加量比值的降低，呈先快速增加后緩慢下降的變化趨勢。在玉米秸稈與麩皮添加量比值為1∶1時，發酵產物腐植酸含量最高，為14.16%。

2.1.2 尿素添加量對產腐植酸的影響 由圖2可知，發酵產物腐殖酸含量隨著尿素添加量的增加，呈量先增后減的變化趨勢。當尿素添加量為0.75%時，發酵產物腐殖酸含量最高，為18.15%。表明添加適量的尿素對枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸有促進作用，當添加量較大時起抑制作用，試驗中尿素添加量為1.5%時，發酵產物腐植酸含量為13.51%，比最高值下降了25.61%。

2.1.3 培養基初始pH對產腐植酸的影響 從圖3可知，發酵產物腐殖酸含量隨著培養基初始pH值的升高，呈先升后降的變化趨勢，在培養基初始pH值為6時發酵產物腐植酸含量最高，為15.39%。表明，該枯草芽孢桿菌比較適合在弱堿性條件下發酵玉米秸稈產腐植酸，過酸環境下產腐植酸能力受到抑制。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 擬合方程和方差分析 BBD試驗設計及結果見表2。應用Design-Expert 軟件對試驗結果進行方差分析（表3），擬合多項式回歸模型并作真實響應面擬合圖。方差分析結果表明：模型P<0.000 1，說明模型極顯著;失擬項P=0.288 0>0.05，說明模型擬合程度好，可以用該模型進行分析和預測。擬合腐植酸含量（Y）的多項式回歸方程為：

Y=19.30-1.08X1+0.37X2+0.32X3-0.028X1X2+0.005X1X3-0.075X2X3-1.63X12-0.75X22-0.71X32

一次項X1（玉米秸稈與麩皮比重）、X2（尿素添加量）、X3（發酵初始pH）對發酵產腐植酸的影響均為極顯著（P<0.000 1），二次項X12、X22、X32對發酵產腐植酸的影響均極顯著（P<0.000 1），交互項中X2X3對發酵產腐植酸的影響顯著（P<0.01）、其他兩個交互項對發酵產腐植酸的影響不顯著。

2.2.2 因素交互作用分析 由圖4可知，隨著尿素添加量的增加和培養基pH的提高，發酵產物腐植酸含量呈先升高后下降的變化趨勢，表明在某一尿素添加量和某一培養基初始pH值條件下，發酵產物腐植酸含量具有極大值。

圖4 尿素添加量和培養基初始pH對發酵的影響

Fig.4 Effects of the additive amount of urea and the initial pH of culture medium on fermentation

2.2.3 響應面優化發酵條件及驗證 通過軟件對回歸模型求極值并將標準變量轉換為實際變量，獲得枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸的最佳條件為：玉米秸稈與麩皮添加量比值為0.95∶1，尿素添加量為0.81%，培養基初始pH為6.1，發酵產物腐植酸含量預測值為19.55%。在該發酵條件下，經5次重復驗證試驗，測得發酵產物腐植酸含量均值為19.58%，與預測值基本相符，說明該模型可以很好地預測實際發酵情況。

3 結論與討論

可以利用枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸，提高玉米秸稈綜合利用價值，減少農業廢棄物帶來環境污染和資源浪費。單因素試驗表明：玉米秸稈與麩皮添加量比值、尿素添加量、培養基初始pH的變化，均會影響枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸的能力。隨著麩皮添加量的增加腐植酸含量先升后降，這可能是玉米秸稈以碳源物質為主，而麩皮含有更為豐富的蛋白質、礦物質、維生素等營養物質，添加適量的麩皮可以促進菌體生長代謝產腐植酸，但麩皮添加量較大時菌體以擴大生物量為主，腐植酸產量反而下降;隨著尿素添加量的增加腐植酸含量先升后降，這可能是尿素作為基礎培育基的補充氮源被菌體利用，添加適量的尿素促進了菌體生長代謝從而增加了腐植酸產能，但添加量過大時尿素對菌體形成毒害作用，抑制了菌體的生長代謝;隨著培養基初始pH的提升腐植酸含量先升后降，這可能是該菌較適生長環境為弱堿性，當培養基過酸或過堿時，菌體細胞膜通透性、膜內酶結構和功能受到影響，抑制了菌體對營養基質的利用和代謝產物的合成與積累。

通過響應曲面法進行試驗設計和分析，結果表明：玉米秸稈與麩皮添加量比值、尿素添加量、培養基初始pH對發酵產物腐植酸含量的影響極顯著，尿素添加量與培養基初始pH的交互作用對發酵產物腐植酸含量的影響顯著;多項式回歸模型擬合程度高，可以用來優化枯草芽孢桿菌發酵玉米秸稈產腐植酸的最佳條件、預測發酵產物腐植酸含量;優化獲得最佳發酵條件為玉米秸稈與麩皮添加量比值0.95∶1、尿素添加量0.81%、培養基初始pH 6.1，經驗證試驗測定發酵產物腐植酸含量為19.58%，較優化前腐植酸含量提高了38.3%。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-09-09

作者簡介：陳勇強，男，1986年生，工程師，主要從事農產品加工推廣。