甘草愈傷組織誘導及帶芽莖段叢生芽增殖條件優化

李偉　張東向　劉麗杰　呂晴　任艷波

摘 要：為篩選適于甘草愈傷組織誘導及帶芽莖段叢生芽增殖的最佳激素配比，選取萌發能力最強的甘草種子作為試驗材料，獲得無菌苗，取其下胚軸和帶芽莖段為外植體，在不同激素配比下誘導愈傷組織，統計愈傷組織的生長狀況、顏色狀態、誘導率和出愈率等指標，并研究不同激素對甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響，統計帶芽莖段叢生芽株高、節間距、真葉數、增殖倍數等指標。結果表明：MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1有利于下胚軸愈傷組織的誘導，MS+6BA 0.2～0.6 mg·L-1有利于帶芽莖段愈傷組織的形成;MS+6BA 1.8 mg·L-1對帶芽莖段的生長最為有利，MS+6BA 1.0～2.2 mg·L-1有利于帶芽莖段叢生芽的增殖，隨著6BA濃度的升高，甘草帶芽莖段叢生芽的增殖倍數也隨之增加。

關鍵詞：甘草;愈傷組織;帶芽莖段;叢生芽;激素

中圖分類號：S 567.23 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）10-0027-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.006

Optimization on the Callus Induction and Proliferation of Cluster Budsfrom Stem Segments with Buds of Glycyrrhiza Uralensis

LI Wei， ZHANG Dong-xiang*， LIU Li-jie， LYU Qing， REN Yan-bo

（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry， Qiqihar University/Heilongjiang Key Laboratory of

Resistance Gene Engineering and Biodiversity Protection in Cold Areas， Qiqihar， Heilongjiang 161006， China）

Abstract： In order to screen the best hormone ratio for callus induction and the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis， the seeds of Glycyrrhiza uralensis with the strongest germination ability were selected as the experimental materials to obtain the aseptic seedlings. The hypocotyls and stem segments with buds were taken as the explants to induce the callus under different hormone ratios， and the growth status， color status， induction rate and healing rate of callus were counted. Then， the effects of different hormones on the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis were studied. And the indicators such as plant height， node spacing， number of true leaves and proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds were counted. The results showed that MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1 and MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1 were conducive to the induction of hypocotyl callus， and MS+6BA 0.2-0.6 mg·L-1 was conducive to the callus formation of the stem segments with buds. MS+6BA 1.8 mg·L-1 was the most beneficial to the growth of the stem segments with buds， and MS+6BA 1.0-2.2 mg·L-1 was conducive to the proliferation of cluster buds from the stem segments with buds. With the increase of 6BA concentration， the proliferation multiple of cluster buds from the stem segments with buds of Glycyrrhiza uralensis also increased.

Key words： Glycyrrhiza uralensis; Callus; Stem segments with buds; Cluster buds; Hormone

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch為豆科Leguminosae甘草屬Glycyrrihiza多年生草本植物，是中國傳統醫學中最古老和最常用的草藥之一。它含有20多種三萜和300多種黃酮類化合物。近年來，研究表明從甘草中分離的活性化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調節功能，同時具有恢復和保護神經、消化、呼吸、內分泌和心血管系統的功效[1]。《中國藥典》2020年版規定甘草有3個來源，即烏拉爾甘草G.Uralensis Fisch.、光果甘草G.glabra Linn. 及脹果甘草G.inflata Batalin.[2]。甘草具有多種藥用價值[3]，由于過度和不可持續的采挖，甘草的野生資源減少得非常迅速，現在雖然甘草在中國西北部地區廣泛種植[4]。但人工栽培易受外界環境影響，因此無性系育苗是保持親本優良特性的首選途徑，特別是植物組織培養方法具有生長周期短、外植體遺傳背景一致性高、生長條件可控制等優勢，可快速、高效的繁育種苗[5]。甘草成材需要2～5年，種子發芽率低，人工育種周期長，進行組織培養快速繁殖就成為對甘草保護性開發利用的最佳途徑[6]。目前，對甘草愈傷組織誘導及帶芽莖段叢生芽增殖條件有一定研究[7-8]。本試驗研究不同激素對下胚軸及帶芽莖段誘導愈傷組織的影響，以及不同激素對帶芽莖段叢生芽增殖的影響，旨在篩選最佳激素配比，為甘草無性快繁提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草種子由齊齊哈爾市昂昂溪區中草藥種植基地提供，試驗使用的藥品未特殊標注均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘草無菌苗及外植體的獲得 將甘草種子用蒸餾水浸泡25 min，再用0.1%升汞浸泡10 min，消毒后，在超凈工作臺內用無菌水淘洗5遍，每遍2 min，將無菌種子接種于經過滅菌的、未添加激素的MS培養基上，每瓶接種10粒，用封口膜封口后，放入恒溫培養箱，溫度25℃，暗培養，每天觀察種子萌發情況，待種子萌發以后，無菌苗生長至5～10 cm，可用于外植體取材。

在無菌條件下，選擇種子萌發能力最強且長勢最好、茁壯、有節段的無菌苗，在超凈工作臺內用滅過菌的鑷子取出，置于事先經高壓滅菌冷卻后的培養皿上，再用滅過菌的解剖刀和鑷子取其下胚軸（0.7 cm）和帶芽莖段（0.7 cm）。

1.2.2 不同激素配比對甘草下胚軸愈傷組織誘導的影響 將獲得的下胚軸接種于添加不同濃度的6BA、2，4D、NAA且經過滅菌的MS培養基上，每瓶接種4個，培養基含3%蔗糖和0.8%瓊脂糖，pH 5.8，溫度25℃，光照周期16 h/d，光照強度2 000 lx，暗培養下則不提供光照。培養基中6BA、NAA和2，4D的濃度梯度見表1，下胚軸誘導愈傷組織共4種培養基，每種處理重復3次，21 d后觀察愈傷組織誘導情況。

愈傷組織誘導率（%）=（形成的愈傷組織塊數/接種外植體數）×100

1.2.3 6BA對甘草帶芽莖段愈傷組織誘導的影響 將獲得的帶芽莖段接種于添加不同濃度6BA且經過滅菌的MS培養基上，每瓶接種4個，培養基含3%蔗糖和0.8%瓊脂糖，pH 5.8，溫度25℃，光照周期16 h/d，光照強度2 000 lx，暗培養下則不提供光照。

采用單因素試驗設計方案，6BA濃度分別為：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，每種處理重復3次，21 d后觀察愈傷組織誘導情況。

1.2.4 不同激素對甘草帶芽莖段叢生芽誘導和增殖的影響 （1）6BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養基，6BA濃度分別為：0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復3次。（2）KT對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養基， KT濃度分別為： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復3次。（3）6BA對甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響。以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養基，6BA濃度分別為： 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg·L-1，每瓶接種4個帶芽莖段（0.7 cm），每種處理重復3次。

增值倍數 =分化出叢生芽個數/接種帶芽莖段數量

1.3 數據分析

利用Excel 2010進行統計和繪制圖表，采用SPSS19軟件進行數據方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對甘草下胚軸愈傷組織誘導的影響

由表2可知，處理1愈傷組織誘導率最高為75%，褐化率為16.67%;處理3誘導率為66.67%，褐化率為16.67%。各組處理愈傷組織生長狀況不同，處理1有3塊達到最好（+++），3塊較好（++），1塊長勢一般（+），2塊褐化，處理3有4塊最好（+++），2塊一般（+），2塊褐化，而處理2誘導率為33.33%，顯著低于其他組合。方差分析表明，處理1與處理2和處理4在愈傷組織塊數上存在顯著差異，與其他組合沒有顯著差異;處理1與處理2在誘導率上存在極顯著差異，與處理4在誘導率上存在顯著差異，與其他組合沒有顯著差異;雖然處理3與其他組合在愈傷組織塊數和誘導率上沒有顯著差異，但其誘導率較高，愈傷組織生長狀態較好，且呈現疏松砂糖狀。綜合分析，選擇MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1和MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1作為繼代培養的激素組合較為有利（圖1）。

2.2 6BA對甘草帶芽莖段愈傷組織誘導的影響

由表3可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和0.5 mg·L-1時，甘草帶芽莖段愈傷組織的生長狀態較好，褐化率維持在較低水平，分別為8.33%和25.00%，6BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1時，愈傷組織生長狀態不如前者，褐化率也顯著高于前者，且伴有不同程度的木質化;6BA濃度在0.2～2.0 mg·L-1時，甘草帶芽莖段均有愈傷組織形成，當6BA濃度為0.2 mg·L-1時形成的愈傷組織最好，白色砂糖狀較多，褐化較少（圖2）。

2.3 6BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

由表4可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1的培養基中，均沒有叢生芽產生;6BA濃度為 1.8 mg·L-1時，帶芽莖段株高、莖節數、真葉片數均達到最大，分別為9.87 cm、5.79個、6.44片，與其他濃度存在極顯著差異;綜上分析，6BA濃度為1.8 mg·L-1時對于甘草帶芽莖段的生長最為有利。

2.4 KT對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

甘草帶芽莖段在表5所示的KT濃度作用下均無叢生芽產生，但卻長出根和愈傷組織。由表5可知，KT濃度為2.2 mg·L-1時，帶芽莖段植株高、莖節數、真葉片數均達到最大，分別為9.24 cm、4.79個、5.37片，其中株高與其他濃度存在極顯著差異;KT濃度在1.0～2.2 mg·L-1范圍內，隨著KT濃度增加，帶芽莖段的株高、莖節數、真葉數均呈現升高趨勢;說明KT對叢生芽誘導作用較小，但對帶芽莖段的生長、生根和愈傷組織誘導均有促進作用（圖3）。

2.5 6BA對甘草帶芽莖段叢生芽增殖的影響

由表6可知，6BA濃度為0.2 mg·L-1和1.4 mg·L-1均沒有叢生芽產生，這與叢生芽誘導的結果一致;6BA濃度為2.2 mg·L-1的培養基中，叢生芽增殖倍數為3.13倍，為各濃度培養基中最高;6BA濃度在1.0～2.2 mg·L-1范圍內，隨著6BA濃度增加，叢生芽的增殖倍數呈升高趨勢;6BA濃度在0.6～1.8 mg·L-1范圍內，隨著6BA濃度增加，叢生芽高及真葉數呈升高趨勢（圖4）。

3 討論與結論

種子萌發是植物體生活史中重要的階段， 直接影響到植物體后期的生長發育和形態建成[9]，甘草種子的萌發受到溫度、光照、水分、pH值、赤霉素和貯藏時間等條件的影響[10]。本試驗采用未添加激素的MS培養基作為種子萌發的培養基，從而進一步獲得無菌苗。愈傷組織的誘導率受一些內部和外部因子的影響，包括：基因型、營養成分、激素、生理狀態和物理因子等。研究表明，甘草下胚軸、子葉、胚根均可作為外植體來誘導愈傷組織，其中下胚軸的愈傷組織無論從狀態還是長勢均為最好[11]。本研究采用甘草下胚軸為外植體，愈傷誘導率最高可達77.78%，這與已有報道一致。甘草帶芽莖段誘導叢生芽試驗中，僅選取6BA和KT兩種植物激素，其他激素仍可做深入研究。

在植物組培快繁中，生長素和細胞分裂素等生長調節劑對培養物的誘導分化起重要作用[12]。張洋等[13]研究顯示MS+6BA 1.0 mg·L-1 +2，4D 2.0 mg·L-1唐古特大黃外植體出愈率最高，且生長快;楊曼等[14]研究表明在富民枳組織培養時，MS+6BA 1.0 mg·L-1 +NAA 2.56 mg·L-1時富民枳愈傷情況最佳;文沛玲等

[15]在研究不同濃度6BA對黑麥草種子出愈率的影響時得出，在一定的濃度范圍內，MS+6BA能夠提高多年生黑麥草愈傷組織的出愈率，但隨著濃度的增加反而會降低黑麥草愈傷組織的出愈率，且6BA濃度均處于較低濃度水平;魏曉雪等[16]研究表明帶芽莖段為百里香組培的最佳外植體材料;劉雪蓮等[17]只添加細胞分裂素6BA的MS培養基叢生芽誘導率高于添加了細胞分裂素和生長素的MS培養基， 但芽叢長勢弱;張延紅等[18]研究顯示6BA 的濃度對叢生芽的顏色、數目、生長速度和健壯度的影響十分顯著;楊瀾等[19]研究表明濃度為2.0 mg·L-1的

6BA處理后的葉藝叢生芽經過成苗培養后，其芽苗的生物增長量均高于6BA的其他濃度處理。KT在植物組織培養中具有促進生根的作用，但芽苗莖節間細長，葉片狹長且根細長，芽苗并不健壯，不利于后期的出瓶移栽。

本試驗研究了不同激素配比對愈傷組織誘導及帶芽莖段叢生芽增殖的影響，結果表明，激素對愈傷組織誘導作用明顯，在下胚軸誘導愈傷組織的試驗中，MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1出愈率最高，但褐化率也較高，MS+6BA 1.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1出愈率為其次，但褐化率較低，且愈傷組織長勢比MS+6BA 1.0 mg·L-1+2，4D 2.0 mg·L-1好;低濃度的6BA對甘草帶芽莖段愈傷組織誘導有利，隨著濃度的升高，雖然愈傷組織誘導率均為100%，但褐化明顯，長勢不好;6BA濃度為1.8 mg·L-1時甘草帶芽莖段的株高、節段、節間距、真葉各項指標均最高，說明此濃度對于甘草帶芽莖段的生長最為有利;不同濃度6BA和KT對帶芽莖段叢生芽誘導的結果表明：6BA對叢生芽的誘導有利，而KT的作用較小。本試驗為甘草快繁提供了理論依據，為快繁體系的建立和優選奠定基礎，對甘草的工廠化規模生產、加快產業化進程起到了促進作用。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-08-02

作者簡介：李偉，男，1984年生，碩士，工程師，主要從事植物生理學與植物生物技術研究。

*通信作者：張東向，男，1963年生，碩士，教授，主要從事植物生理學與植物生物技術研究（E-mail：zhangdx1019@163.com）。

基金項目：黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目 （YSTSXK201887）;齊齊哈爾市科技攻關項目（SFGG201575）;齊齊哈爾大學研究生創新項目（YJSCX2019044）。