毛細管電泳分離分析氨基酸虛擬仿真實驗設計及應用*

孔 宇，劉 宇，張艷英，李 華，孫書洪，亓樹艷，姜 曼

(1 西安交通大學 生命科學與技術學院 陜西省生命科學實驗教學示范中心，陜西 西安 710049;2 北京微瑞集智科技有限公司，北京 100000)

毛細管電泳技術是生化分析領域一種常見的分離分析方法，其原理是待分離物質因荷質比等理化性質不同，在毛細管內的直流電場中差速遷移而得到分離。與傳統分離方法相比，毛細管電泳有著需樣量小、效率高、分離周期短等優點，在生化分析領域有較強的應用優勢，是生化類專業學生需要掌握的一項必要的技術。然而在實際教學過程中，因毛細管電泳儀價格昂貴、普及率低，操作難度高等因素的限制，實體實驗很難開展，影響了學生實驗技能的培養[1-2]。因此，開發毛細管電泳相關的虛擬仿真實驗，可充分發揮虛擬仿真實驗不受時間、空間限制，容錯，低成本等優勢[3-4]，可使學生近距離“接觸”毛細管電泳儀，不受限制地學習儀器工作原理，掌握儀器操作技能，鞏固理論課程知識，提升實驗教學效果。

項目擬以生化分析實驗中的氨基酸分離分析實驗為背景，開發基于毛細管電泳技術的虛擬仿真實驗，虛擬仿真實驗項目中實驗虛擬場景采用使用Maya和3DMax軟件進行整體實驗室3D建模；虛擬實驗操作利用Unity3D平臺進行三維操作設計[5]，通過Mysql進行數據收集和管理，最終建立基于B/S架構的毛細管電泳虛擬仿真實驗系統，詳細如下。

1 基于培養目標的毛細管電泳虛擬仿真實驗內容設計及實現

氨基酸分離分析技能是“生化分析實驗”中學生應掌握的核心內容之一，要求學生在掌握氨基酸的性質(如等電點、分子量、極性、官能團等)的基礎上，學會利用常見分離分析方法完成混合氨基酸樣本的分離分析。而生化類實驗中涉及的常見分離分析方法有紙層析[6]、液相色譜[7-8]等，均存在氨基酸需衍生化，多組分同時分離難，實驗操作照方抓藥、學生參與度低、積極性差等不足，限制了實驗的效果。因此在開發虛擬仿真實驗操作界面和設計實驗內容時，緊扣大綱要求[9]、針對上述瓶頸，發揮虛擬仿真實驗的優勢，并結合“兩性一度”相關設問，提升學生能力培養，以期達到最佳效果。

1.1 學生應掌握的重要知識點和技能分析

1.1.1 物質(氨基酸)等電點及帶電性計算：

等電點和物質帶電性的計算(以氨基酸為例)是生化分析類課程的重要知識點之一。課程中要求學生將理論課程中的相關知識應用于氨基酸帶電性質的判斷和計算上，即掌握等電點計算原理(分為酸性、中性、堿性、側鏈基團解離等四大類)和推導、使用計算公式(如式1)。此外，在掌握等電點計算的基礎上，對學生提出高階性問題：如何計算給定pH下氨基酸(可拓展至兩性物質)的帶電荷數量？相應計算原則及公式(pKa>或

等電點計算公式：

pI=1/2(pKa1+pKa2)

(1)

當pH

(2)

當pH>pKa2時，氨基酸帶有負電荷，氨基酸所帶負電荷E2，可用式3表示。

(3)

1.1.2 毛細管電泳的原理及影響毛細管電泳分離的因素

毛細管電泳原理方面：需掌握電滲流產生的機制、荷電物質在毛細管內的分離特點。影響毛細管電泳分離分析的條件因素方面：需掌握pH、緩沖液濃度、電壓、溫度、毛細管長度等因素對分離的影響。涉及計算公式如式4，式5所示。

VEOF=μE=ε0εξE=Lef/tEOF

(4)

式中：VEOF為電滲流速率，ε0為真空介電常數，ε為介電常數ξ為毛細管壁的Zeta電勢，E為場強，Lef為毛細管有效長度，tEOF為電滲流標記物(中性物質)的遷移時間。

(5)

式中：V為離子遷移速率，q為離子帶電荷數，r為離子半徑，η為溶液粘度。

1.1.3 實驗方案設計能力和實驗數據分析能力

虛擬仿真實驗結果輸出形式為電泳圖和各物質遷移時間、峰高、峰寬、峰面積等參數，實驗中要求學生能利用所得參數進行數據處理，獲得分離柱效、分離度等衡量分離策略優劣的評判參數，結合條件實驗進行分離策略的優化；此環節著重提升學生的分析解決問題的能力。參考的計算公式如式6，式7所示，此部分內容在虛擬仿真實驗原理部分展示。

(6)

(7)

式中：N為柱效，t為遷移時間，w1/2為半峰寬。

1.1.4 毛細管電泳儀的操作流程及注意事項

需學生了解毛細管電泳儀器部件構成，掌握包含開機、毛細管安裝、光纖連接、樣品擺放、方法編輯、條件選擇、運行分離過程、結果比對分析、關機等操作步驟，明確注意事項。

1.2 針對教學核心目標的虛擬實驗設計及實踐

1.2.1 網站總體界面及功能

虛擬仿真實驗網站設計時，考慮應支撐教學前、實驗后等環節，增強教學效果。除實驗部分(開始實驗)外，設計了申報視頻(實驗教學視頻)，預習測試(針對實驗原理學習效果)，填寫報告(提交實驗報告，也可由系統自動生成)，實驗結果(用于學生回收實驗數據及結果)，實驗須知(實驗注意事項等)環節。為增進互動，開設了通知公告，師生交流、練習數值等欄目，網頁主界面見http://xjtu.dlvrtec.com網頁。

1.2.2 核心教學目標的實現

1.2.2.1 氨基酸等電點、帶電性的計算和分離pH的設計

在原理講述部分設有公式推導的教學課件，由學生自行學習，推導相應公式。在實驗時，為避免學生之間因相互借鑒而降低實驗挑戰度，隨機給每個學生分配5種氨基酸，由學生各自獨立計算出所分配氨基酸的等電點(知識應用能力考查)，并設計分離緩沖液的pH(綜合設計能力)，同時計算該pH下，給定5種氨基酸的帶電荷情況(挑戰度題目，教師有全pH各氨基酸帶電荷情況表和excel版氨基酸帶電荷情況自動計算表格)。此環節中，學生自主完成公式的推導和應用，教師依據學生設計條件確定是否正確，是否可行。

1.2.2.2 毛細管電泳的原理及影響毛細管電泳分離的因素的學習

通過幻燈片形式展示毛細管電泳原理，通過設置配套選擇題來檢驗學生學習效果。依據學習基礎，結合上一步驟學生的氨基酸帶電程度計算結果和選定pH，學生可自由對其他毛細管電泳條件進行設置。本虛擬仿真實驗將常見的影響毛細管電泳分離效果的參數，如電壓、緩沖液濃度、毛細管有效長度等，均納入模擬范圍，實現對學生方案設計能力的全面考查。

1.2.2.3 結果的分析與方案修正

完成上述毛細管電泳分離得到實驗結果后，學生首先學會電泳峰參數(峰面積、峰高、遷移時間)的采集和柱效、分離度等分離效果評價指標的計算方法，然后依據評價指標確定是否達標。若實驗結果不理想(如分離度不符合要求等)，允許學生返回參數設置界面，重新設置新參數，再次嘗試，直至得到理想結果為止。圖1為學生針對不理想的實驗結果(圖1B、1D)，對電壓、溫度等因素調節前后分離情況變化對比圖(圖1A、1C為較理想的分離圖)。從圖1可以看出，虛擬仿真軟件可實時針對設定參數動態預測分離結果。此過程亦可實現學生分析、解決問題的能力培養。

圖1 虛擬實驗結果示例圖

1.2.2.4 虛擬實驗操作訓練

虛擬仿真實驗高真實度構建了涵蓋開機、卡套安置、光纖安裝、樣品擺放、方法編輯、條件選擇、運行、結果比對、方案修正、關機等步驟的實驗體系，簡要如圖2所示。通過學習和虛擬實驗操作，學生可熟悉并掌握毛細管電泳儀器的操作基本流程和注意事項，為實體實驗打下基礎。

圖2 實驗操作流程示例圖

2 交互性操作步驟說明

為增強實驗效果，設置了多處提問互動點，如實驗前講述毛細管電泳的相關基礎知識，針對這些基礎知識提出相應的思考問題，加深學生對基礎知識的理解和掌握，為后續的實驗開展提供理論支持。實驗過程中，針對實驗中的一些現象亦有互動式交流與提問。又如毛細管電泳過程中的每個參數(緩沖液pH值/分離電壓/溫度/氨基酸分子量等)在理論上如何影響分離結果(高階性問題)等等。在實驗操作過程中，學生可點擊上邊框流程欄，隨時了解所在實驗環節的要求及在整個流程中的定位和完成情況。此外，虛擬仿真實驗還設置了容錯及有償(獲得提示的同時，上邊框中得分值會自動減少)提示功能，保障學生對實驗流程整體的掌握，滿足不同教學要求。

3 應用情況

基于氨基酸分離的毛細管電泳虛擬仿真實驗從2019年開始運行，已有110余位學生使用，通過率90%。學生評價優良。抗擊疫情期間，支撐學院碩士研究生和本科生畢業論文中毛細管電泳的分離理論模擬工作，預測結果與實際分離分析結果相似度高。程序開發和設計工作亦有本科生參與，并獲批軟著權專利2份。

4 結 語

開發的毛細管電泳虛擬仿真實驗依據毛細管電泳的理論，以氨基酸的分離分析為教學背景，參考大量實驗數據，回歸得到了多個理論參數，編寫程序較準確地預測和還原了真實實驗結果；基于unity的VR操作實現了高真實度的儀器操作和互動，非常有利于學生操作能力的訓練和基于實驗數據分析問題、設計解決方案的能力。后續將增加毛細管電泳在線堆積技術等其他毛細管電泳分離模式的模擬，開發手機版程序等，并將實驗項目推廣至分析化學類專業的VR教學中。