智能有機納米光敏劑的綜合研究型實驗設計*

吳風收，李浩蘭，蘇夢亞，李郭靜

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205)

手術、化療和放療等傳統療法毒副作用大、易復發、治療周期長[1-2]。近紅外(NIR)光激活光療法，如光熱療法(PTT)和光動力療法(PDT)，由于具有高效、微創等優點而受到廣泛關注[3-5]。目前，大多數開發的光熱劑都集中在無機材料上，如碳基納米材料、金納米棒和金屬納米結構[6-7]。然而，這些材料的不可生物降解性阻礙了其進一步的臨床轉化[8-10]。相比之下，具有良好生物相容性和可生物降解性能的有機光熱劑具有更好的前景[11-12]。因此，探索近紅外吸收強、高光熱轉換效率的有機光敏劑具有重要意義。

在此背景下，我們以1,6-二(三甲基乙炔基)芘和氟硼二吡咯為單元，設計并合成了一種基于具有D-A結構的共軛有機聚合物 (P-BDP)，通過納米沉淀法將聚合物制備成納米顆粒(P-BDP NPs)[13]。通過紫外吸收光譜、熒光發射光譜、凝膠滲透色譜(GPC)等手段，對化合物中間體和聚合物進行結構及光物理性質表征。與聚合物P-BDP相比，P-BDP NPs 顯示出更寬和紅移的吸收光譜，最大吸收峰值在603 nm。在單次近紅外激光(635 nm)照射下，P-BDP NPs可以同時產生光動力和光熱效應，光熱轉換效率高達52%。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

試劑：氟硼二吡咯(NI-BDP)由本實驗室前期合成并報道2，1,6-二(三甲基乙炔基)芘，N-碘代丁二酰亞胺(NIS)，三苯基膦，四三苯基膦鈀(Pd(PPh3)4)，碘化亞銅(CuI)，三乙胺(TEA)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(MeOH)，四氫呋喃(THF)等試劑購自于伊諾凱化學試劑公司。實驗儀器：IKA RET basic型油浴鍋，R2010型旋轉蒸發儀，METTLER ToLeDo ME104E型分析天平，Agilent 400MR核磁共振儀，TU-1901紫外-可見光譜儀，Fluoromax-4c-L熒光光譜儀，ZS90粒徑儀，Bruker Auto MALDI-TOF 質譜儀。化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 P-BDP的合成及其納米顆粒P-BDP NPs的制備

1.2 NI-BDP的合成

在氮氣氣氛下，將2,4-二甲基吡咯(0.24 g, 2.50 mmol)、化合物6(0.47 mg, 1.00 mmol)溶解于120 mL干燥的二氯甲烷中，攪拌30 min后加入10 μLTFA做催化劑，于室溫下攪拌6 h后，添加溶于30 mL DCM的DDQ(0.23 g, 1.00 mmol)，氧化3 h后，加入2.0 mL Et3N淬滅反應，攪拌15 min后加入2 mL BF3·Et2O，于室溫下再攪拌3 h。真空除去溶劑，并將殘余物用二氯甲烷和水萃取，有機相經無水Na2SO4干燥后減壓濃縮。將所得殘余物經柱層析分離，DCM作為洗脫劑。收集第二個熒光點，重復柱層析直至得到純凈的目標化合物，得橙黃色晶體(117 mg, 22.5%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8.67 (s,J=7.7 Hz, 2H, ArH), 8.18 (d,J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.75 (dd,J=18.1 Hz, 2H, ArH), 7.65 (d,J=7.9 Hz, 2H, ArH), 7.49 (d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 6.04 (s, 2H, CCHC), 4.46 (t,J=6.0 Hz, 2H, OCH2), 3.89～3.42 (m, 12H, OCH2), 2.57 (s, 6H, CH3), 1.54 (s, 6H, CH3), 1.16 (t,J=7.0 Hz, 3H, CH2CH3). MALDI-TOF MS: calcd for: 679.56, found: 679.30。

1.3 I-BDP的合成

將NI-BDP(100 mg, 0.15 mmol)與NIS(83 g, 0.45 mmol)一起溶解在15 mL無水DCM中。在30℃下攪拌0.5 h，TLC監測反應進程。用飽和的Na2SO3水溶液除去過量的NIS以防環境污染，并用DCM萃取。經無水Na2SO4干燥后減壓濃縮，并通過柱色譜法純化，洗脫劑為DCM。得紫紅色固體結晶(125 mg, 90%)。表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8.67 (d,J=4.7 Hz, 2H, ArH), 8.17 (d,J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.73 (dd,J=35.7 Hz, 4H, ArH), 7.47 (d,J=7.3 Hz, 2H, ArH), 4.48 (d,J=4.9 Hz, 2H, OCH2), 3.93-3.38 (m, 12H, OCH2), 2.66 (s, 6H, CH3), 1.56 (s, 6H, CH3), 1.17 (dd,J=7.7 Hz, 3H, CH2CH3). MS (ESI):m/z=930 [M]+; 804 [M-I]+。

1.4 P-BDP的合成

將I-BDP(40.27 mg, 0.05 mmoL)、1,6-二乙炔基芘 (25.03 mg, 0.1 mmol)、Pd(PPh3)4(7 mg, 6 μmol)和CuI (1.50 mg, 8 μmol)和 MeOH/TEA混合溶液(24 mL)加入到 100 mL三口燒瓶中，在N2保護下升溫至90 ℃回流攪拌72 h。反應完成后，減壓濃縮，除去溶劑。用少量THF充分溶解固體，然后加入大量甲醇，直至溶液表面有少量漂浮物析出，靜置以便析出更多固體。然后離心，倒掉溶液，留下固體，繼續重復雙溶劑重結晶操作，洗至離心出的溶液無色，然后干燥，得到藍黑色固體P-BDP聚合物。

1.5 P-BDP納米顆粒(P-BDP NPs)的制備

在超聲處理下，將3 mL P-BDP (3 mg)的THF溶液滴入 30 mL去離子水中。隨后，室溫下鼓泡8 h去除THF，得到P-BDP NPs的澄清水溶液。

1.6 樣品表征

使用核磁共振氫譜對化合物中間體確認分子的結構，使用凝膠滲透色譜系統確定P-BDP聚合物的分子量。利用ZS90粒徑儀確定P-BDP納米顆粒的尺寸和電位。利用TU-1901紫外-可見光譜儀和Fluoromax-4c-L熒光光譜儀來測定P-BDP NPs納米顆粒的吸收光譜和發射光譜。

1.7 光熱性能測試

在635 nm激光(1.5 W/cm2) 的照射下測量不同P-BDP NPs 溶液濃度(0、50、150和250 μg/mL)的溫度升高情況。同時，在固定的P-BDP NPs濃度(200 μg/mL)下，以不同的功率密度(0.5、1.0和1.5 W/cm2)的635 nm激光進行照射，并記錄溶液的升溫情況。另外，我們通過5次加熱和冷卻循環實驗探究了P-BDP NPs的光熱穩定性，并通過相關公式計算P-BDP NPs的光熱轉換效率。水溶液的溫度使用紅外熱像儀進行記錄。納米顆粒的光熱轉換效率由下式計算。

根據前述方法，由公式(1)測量光熱轉換效率(η)：

(1)

其中，h是傳熱系數；s是容器的表面積；hs的值由公式(2)確定；QDis代表由溶劑和容器介導的激光耗散的熱量，值由等式(5)確定；I是激光功率；A是635 nm的吸光度。

(2)

其中，m是包含光敏材料的溶液的質量，C是溶液的比熱容，τs是系統傳熱的時間常數，可以從等式(3)確定。

t=-τsln(θ)

(3)

其中，θ是無量綱參數，稱為驅動力溫度，使用公式(4)計算。

(4)

其中TMax和TSurr分別是最高穩態溫度和環境溫度。

(5)

1.8 光動力性能測試

以2',7'-二氯熒光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 作為活性氧(ROS)探針，測量 635 nm 激光照射后P-BDP NPs的ROS生成情況。DCFH-DA首先用氫氧化鈉溶液處理轉化為DCFH。隨著激光照射時間的延長，記錄P-BDP NPs和DCFH混合溶液從500到600 nm區間的熒光光譜變化情況。為了進行比較，使用未添加P-BDP NPs的DCFH 空白溶液作為對照。同時，以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)為單線態氧(1O2)捕集劑，以亞甲基藍(DMF和H2O的混合溶液中φΔ= 0.52)為商品化的光敏劑作為標準，測量635 nm激光照射下P-BDP NPs的1O2量子產量。具體地，實驗最初加入50 μM DPBF，然后加入光敏劑(P-BDP NPs或亞甲基藍)，將光敏劑的濃度調整到1 μM。分別用 635 nm 激光照射 0、30、60、90、120、150和180 s后測量DPBF的吸光度。根據公式(6)計算光敏劑的1O2量子產率。

(6)

2 結果與討論

2.1 P-BDP的結構表征

P-BDP的凝膠滲透色譜(GPC)如圖2所示，峰值分子量為2212，表明合成的P-BDP聚合物至少有兩個分子單元，為低聚物有機分子。

圖2 聚合物P-BDP的凝膠滲透色譜

2.2 有機納米顆粒(P-BDP NPs)的粒徑分析

如動態光散射(DLS)(圖 3a)所示，P-BDP NPs的平均尺寸約為132 nm。因此，適當大小的P-BDP NPs 可能會通過高通透性和滯留(EPR)效應促進其被動積累到腫瘤部位。P-BDP NPs的zeta電位為+60.2 mV(圖 3b)，因而可通過靜電排斥作用增強粒子的穩定性，并降低被血清蛋白的吸附。

2.3 紫外吸收與熒光發射光譜

如圖3c 所示，與I-BDP相比，P-BDP在二氯甲烷中顯示出明顯的紅移和更寬吸收光譜，最大峰位于588 nm。在自組裝成納米顆粒后，P-BDP NPs在近紅外區域的吸收紅紅移至603 nm，這可能是由于納米結構中有機分子的π-π聚集造成的。從圖3d中的熒光光譜可以看出，在488 nm激發下，P-BDP表現出明顯的紅光發射，而組裝成納米顆粒后，P-BDP NPs的熒光基本猝滅，這可能歸因于分子間π-π聚集導致分子內電荷轉移，能量以熱量的形式耗散。

圖3 (a) P-BDP NPs在水中的 DLS 尺寸分布；(b) P-BDP NPs在水中的 zeta 電位；(c) I-BDP、P-BDP和P-BDP NPs的吸收光譜；(d) P-BDP和P-BDP NPs的熒光光譜

2.4 光熱性能分析

如圖4a所示，P-BDP NPs溶液在激光照射下(635 nm， 1.5 W/cm2)發生顯著的升溫。例如，當P-BDP NPs為 250 μg/mL時，P-BDP NPs溶液在激光照射10 min后溫度升高了21.3 ℃，而在相同的輻照條件下，純水的溫度僅升高了1.9 ℃，表明P-BDP NPs具有很高光熱轉換效率。此外，P-BDP NPs 溶液在激光照射下的升溫情況顯示出激光功率依賴性行為。如圖4b所示，當采用0.5和1.5 W/cm2635 nm激光照射10 min后，P-BDP NPs溶液(20 μg/mL)的溫度分別升高了8.3 ℃和21.3 ℃，表明激光功率密度越高，升溫效果也越明顯。圖4c顯示，P-BDP NPs溶液在激光照射前后其紫外吸收光譜無明顯變化，表明其具有較好的光穩定性。通過測量 635 nm激光照射下和關閉激光后溶液的溫度變化，來計算P-BDP NPs的光熱轉換效率(PCE)(圖 4d)。根據冷卻時間(t)與溫度的負自然對數(-lnθ)的線性曲線來計算系統傳熱的時間常數(τ)，τ為348.9 s，如圖4e所示。根據報道的方法和相關公式[]，計算出P-BDP NPs的PCE為52%。同時可以看出，經過五次加熱和冷卻循環后(圖 4f)，P-BDP NPs溶液的溫度變化并不明顯，表明納米光敏劑具有優異的光熱穩定性。

圖4 (a)激光輻照(635 nm，1.5 W/cm2)10 min，不同濃度的P-BDP NPs溶液的溫升曲線； (b)不同功率密度(635 nm)激光輻照下250 μg/mL P-BDP NPs的溫升曲線；(c) 輻照前后P-BDP NPs的吸收光譜(635 nm, 1.5 W/cm2, 10 min)；(d) 250 μg/mL P-BDP NPs在635 nm激光照射(1.5 W/cm2)下的光熱效應，在沒有照射的情況下冷卻10 min；(e)冷卻時間與溫度的負自然對數之間的線性關系；(f) P-BDP NPs光熱穩定性實驗，采用五個交替的開/關激光照射周期(250 μg/mL，1.5 W/cm2)

2.5 光動力性能分析

活性氧探針DCFH-DA(2,7'-二氯熒光素二乙酸酯)可以被氫氧化鈉溶液水解DCFH，繼而被ROS氧化成綠色熒光發射的DCF[5]。如圖5a所示，DCFH與P-BDP NPs混合后的熒光強度隨著光照時間的延長而增強，而未加入P-BDP NPs的對照組在相同條件下沒有表現出明顯變化，表明P-BDP NPs在激光照射后可誘導ROS的生成。單線態氧(1O2)是ROS最主要的一種。以1,3-二苯基異苯并呋喃 (DPBF) 為捕集劑，亞甲基藍為參比，測定了激光照射下P-BDP和P-BDP NPs的1O2量子產率。如圖5b所示，在激光照射下，在P-BDP或P-BDP NPs存在下，DPBF的吸光度顯示出時間依賴性降低，同時可觀察到P-BDP NPs下降趨勢與P-BDP相當，說明經納米沉淀法組裝成納米顆粒后，其單線態氧產率無明顯變化。

圖5 (a) 隨著光照時間的延長，DCFH在525 nm處的熒光強度變化情況；(b) 在P-BDP NPs存在下DPBF 在414 nm處的吸收強度變化隨著光照時間延長的函數

3 教學效果與反思

(1)本實驗圍繞腫瘤的光學治療這一重要科學問題而提出，內容緊密聯系實際，主題接近生活，易于激發學生的學習和科研興趣。學生通過查詢相關科研文獻，對腫瘤的治療方案有一定認識后，可以開始著手此項實驗的開展。本實驗可以讓學生認識和理解有機化合物的合成方法及納米材料的結構性能。學生通過本實驗的科研訓練后，不但可以拓寬知識面，提升自己的實驗操作技能，還能領悟科學研究的思路和方法，為今后的科研工作打下堅實基礎。

(2)教師在指導學生開展此項研究工作時，要注重文獻講解和實驗操作解析相結合。通過啟發式教育，引導學生進行深入的思考，讓學生在實驗操作中領悟各個實驗環節的原理，讓學生不但要知其然，還要知其所以然，培養學生的創新意識和理念。當實驗結束時，要求學生進行實驗總結，并對各項實驗結果進行反思。同時，組織學生進行討論，分享各自成功和失敗的經驗，對一些有建設性的成功經驗和創新性想法進行匯總。對本研究主題感興趣的同學可以加入教師的課題組自行提出實驗方案，在與指導教師充分討論后可以獨立開展相關課題實驗。

4 結 語

本文以氟硼二吡咯為核心，設計并合成了具有D-A結構的共軛聚合物分子(P-BDP)及其納米顆粒。P-BDP在近紅外區域表現出有效的吸收和較強的熒光。在自組裝成納米顆粒后，P-BDP NPs 的吸收進一步紅移，最大峰值在603 nm處。在635 nm激光照射下，P-BDP NPs可以同時產生活性氧和光熱效應。經計算，P-BDP NPs的光熱轉換效率高達52%。本實驗涵蓋了有機光敏劑的合成及光譜解析、納米顆粒的制備和表征、納米顆粒的光熱及光動力性質測試及分析等知識點，有利于培養學生的科學思維和創新實踐能力。