氨基酸衍生物的非水毛細(xì)管電泳分離研究

謝銀鳳，石瑞卿，張 輝

(1 山東省濰坊生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 濰坊 261041;2 北京華企動(dòng)力信息技術(shù)有限公司，北京 100089)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，在生命有機(jī)體新陳代謝的過程中起著關(guān)鍵作用，研究其分離分析在食品科學(xué)、生物化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著十分重要的意義[1-3]。大多數(shù)氨基酸本身沒有天然的紫外或熒光吸收，為拓展其檢測(cè)的技術(shù)手段，提高其分離選擇性和分析靈敏度，經(jīng)常需要對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前衍生。目前，氨基酸的分離分析研究通常采用氣相色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行[4-6]。

非水毛細(xì)管電泳 (NACE)，作為毛細(xì)管電泳一個(gè)相對(duì)較新的分支，近年來備受分析工作者的青睞[11-14]。與水介質(zhì)毛細(xì)管電泳相比，非水毛細(xì)管電泳有以下優(yōu)越性：允許使用大孔徑的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離分析；體系較低的電流允許使用高電壓以縮短分離時(shí)間；增大疏水物質(zhì)溶解度，減少毛細(xì)管壁對(duì)其的吸附，有效降低焦耳熱。董玉明等以4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑 (NBD-Cl) 為柱前衍生試劑，采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)了丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸四種氨基酸的非水毛細(xì)管電泳分離[7]。本文采用2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯 (DBCEC-Cl)[8]作為氨基酸衍生化試劑，首次實(shí)現(xiàn)了15種氨基酸衍生物的非水毛細(xì)管電泳分離，結(jié)果滿意。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

HP-3D毛細(xì)管電泳儀，美國 Agilent公司(毛細(xì)管總長(zhǎng)58.5 cm，有效長(zhǎng)度50 cm，內(nèi)徑50 μm)。

氨基酸，美國 Sigma公司；甲酰胺(分析純)，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，山東禹王集團(tuán)化工廠；水為 Milli-Q 超純水；其它試劑皆為為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

DBCEC-Cl的配制：精確稱取20.9 mg DBCEC-Cl，用色譜純乙睛溶解后定容于10 mL容量瓶，配成5×10-3mol/L 溶液。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用 6 mol/L鹽酸溶解，然后 6 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為中性或弱堿性，再用 pH為9.0的硼酸緩沖溶液定容到所需體積，即得到1.0×10-2mol/L 的單一氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各種低濃度氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液用上述硼酸緩沖液稀釋配制。標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 氨基酸的衍生化

依次取50 μL pH 為9.0的硼酸緩沖液 (0.1 mol/L)， 20 μL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 (5×10-3mol/L)，120 μL衍生試劑(5×10-3mol /L)于2 mL安瓿瓶?jī)?nèi)，振蕩混合均勻，密封后于40 ℃水浴中衍生20 min，然后用20 μL 50 %的乙酸水溶液調(diào)節(jié)pH為弱酸性，放至室溫，進(jìn)樣分析。衍生化反應(yīng)如圖1所示。

圖1 2-[2-(7H-二苯并[a, g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)與氨基酸衍生化反應(yīng)

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

不同濃度的乙酸、乙酸銨緩沖溶液由甲酰胺為溶劑配制而成。在不同電壓和溫度下，采用290 nm二極管陣列檢測(cè)，分別對(duì)氨基酸衍生物進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)前對(duì)緩沖溶液進(jìn)行超聲脫氣處理。每次進(jìn)樣前，按順序用0.1 mol/L NaOH溶液(5 min)、超純水(5 min)，緩沖溶液(3 min)沖洗毛細(xì)管柱。更換緩沖液時(shí)，需分別用上述三種溶液沖洗10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 電解質(zhì)的選擇

在有機(jī)溶劑中加入電解質(zhì)使其具有導(dǎo)電性是實(shí)現(xiàn)非水毛細(xì)管電泳分離的必要條件。常用的電解質(zhì)有乙酸銨、乙酸鎂、三羥甲基甲酰胺、甲酸、檸檬酸、甲磺酸等，其中乙酸銨比較常用，一般還需加入乙酸共同調(diào)節(jié)介質(zhì)的酸堿緩沖性能。緩沖溶液濃度的大小可以明顯影響電滲流、焦耳熱、離子強(qiáng)度、電解質(zhì)的粘度和毛細(xì)管壁對(duì)分析物的吸附，有效改善分離效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選用常用的乙酸銨-乙酸體系為電解質(zhì)，分別對(duì)乙酸銨、乙酸濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 乙酸銨濃度對(duì)分離的影響

在固定其它實(shí)驗(yàn)條件下，以鳥氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、異亮氨酸(IIe)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Pro-OH)為代表，考察了乙酸銨緩沖體系在60～80 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)四種氨基酸衍生物遷移時(shí)間、分離度和理論塔板數(shù)的影響(見圖2a，2b，2c)。可以看出，遷移時(shí)間隨著乙酸銨濃度的增加而延長(zhǎng)。乙酸銨濃度為70 mmol/L時(shí)，雖然遷移時(shí)間相對(duì)60 mmol/L和65 mmol/L較長(zhǎng)，但理論塔板數(shù)較高，分離度也較為理想，故選擇70 mmol/L作為乙酸銨最佳分離濃度。

圖2 乙酸銨濃度對(duì)遷移時(shí)間(a)、分離度(b)和理論塔板數(shù)(c)的影響

2.1.2 乙酸濃度對(duì)分離的影響

在固定乙酸銨濃度的前提下，調(diào)節(jié)乙酸的濃度可顯著改變分析物粒子間的作用力，改善分離。在固定其他實(shí)驗(yàn)條件的情況下，以鳥氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、異亮氨酸 (IIe)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Pro-OH)為代表考察了乙酸濃度在0.55～0.75 mol/L范圍內(nèi)對(duì)遷移時(shí)間、分離度和理論塔板數(shù)的影響(見圖3a，3b，3c)。由圖3可知，遷移時(shí)間隨乙酸濃度的增加呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在0.65 mol/L時(shí)遷移時(shí)間最短。與此同時(shí)，理論塔板數(shù)和分離度也較為理想，故選擇0.65 mol/L為乙酸最優(yōu)分析條件。

圖3 乙酸濃度對(duì)遷移時(shí)間(a)、分離度(b)和理論塔板數(shù)(c)的影響

2.2 電壓對(duì)分離的影響

分離電壓在毛細(xì)管電泳分離中有著重要作用，可直接影響電滲流大小、焦耳熱、分離度和遷移時(shí)間等。與水介質(zhì)毛細(xì)管電泳相比，非水毛細(xì)管電泳的電流和焦耳熱相對(duì)較小，從而允許使用較高的分離電壓。當(dāng)然，分離電壓過高也會(huì)導(dǎo)致焦耳熱的影響加劇，柱效下降。實(shí)驗(yàn)比較了24 kV、27 kV和30 kV電壓下對(duì)衍生物的分離影響(見圖4)。結(jié)果顯示，遷移時(shí)間隨電壓的升高而明顯縮短，部分衍生物分離度有所增加，基線穩(wěn)定性和焦耳熱未見明顯變化，因此選定30 kV為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)電壓。

圖4 電壓對(duì)氨基酸衍生物分離的影響

2.3 溫度對(duì)分離的影響

毛細(xì)管電泳分離過程中保持柱溫恒定，可在一定程度上散逸分離過程中產(chǎn)生的焦耳熱和改善分離。在較高溫度下操作，可縮短分離時(shí)間，亦可克服某些難溶性分析物的不足。但柱溫過高，不僅會(huì)導(dǎo)致有機(jī)溶劑的揮發(fā)，還會(huì)導(dǎo)致較大的焦耳熱，使柱效降低，從而導(dǎo)致分離效率降低。實(shí)驗(yàn)溫度考察范圍為 12～21 ℃，發(fā)現(xiàn)在18 ℃時(shí)基線較為平穩(wěn)，重現(xiàn)性好，最終選定18 ℃為毛細(xì)管柱溫度。

2.4 氨基酸衍生物的分離

按上述優(yōu)化條件，50 Mbar壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間8 s，以甲酰胺作溶劑，乙酸銨濃度70 mmol/L，乙酸濃度0.65 mol/L，分離電壓30 kV，柱溫18 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，對(duì)15種DBCEC-Cl氨基酸衍生物進(jìn)行了分離，結(jié)果見圖5和表1。

圖5 氨基酸衍生物的非水毛細(xì)管電泳分離圖

表1 氨基酸衍生物最佳的分離參數(shù)

3 結(jié) 論

用實(shí)驗(yàn)室自行合成的2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)作為氨基酸衍生試劑，以甲酰胺為溶劑，乙酸銨-乙酸為緩沖體系，二極管陣列進(jìn)行檢測(cè)，獲得了氨基酸衍生物的非水毛細(xì)管電泳基線分離，建立了氨基酸在毛細(xì)管電泳中分離分析的一種新方法。