基于3D QSAR技術(shù)從毛冬青中篩選NF-кB小分子抑制劑

李 璐，田人魁，吳釘紅

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

NF-кB(Nuclear factor kappa B)是一種細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在大多數(shù)細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，參與調(diào)節(jié)了免疫細(xì)胞的活化、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)，是免疫和炎癥通路中極為重要的轉(zhuǎn)錄因子。NF-кB在膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)[1]、過(guò)敏性鼻炎[2]、哮喘[3]等各種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，而在一些常見的婦科炎癥性疾病的病理過(guò)程中，同樣離不開NF-кB的參與。研究表明，慢性盆腔炎[4]、子宮內(nèi)膜炎[5]、需氧菌性陰道炎[6]、慢性輸卵管炎[7]、外陰陰道假絲酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis, VVC)[8]等婦科炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制與NF-кB密切相關(guān)。NF-кB可通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子、粘附因子、細(xì)胞因子、酶及凋亡基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞粘附、侵襲、血管生成及凋亡, 病變組織產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子和趨化因子依賴于NF-кB,因此長(zhǎng)期以來(lái)NF-кB都被當(dāng)作新型抗炎藥物的靶點(diǎn)，而發(fā)展NF-kB抑制劑，也有利于在臨床應(yīng)用中挖掘更有效的治療方案。

本院針對(duì)盆腔炎開發(fā)了多種以毛冬青為主藥的中藥復(fù)方院內(nèi)制劑，臨床療效良好，我們推測(cè)毛冬青可能具有較好的抗炎作用，甚至具有抑制NF-κB的活性。但是目前尚未對(duì)其活性進(jìn)行深入的研究。三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)是一種獨(dú)立可靠的藥物設(shè)計(jì)工具，通過(guò)對(duì)分子三維結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系研究，為進(jìn)一步的藥物開發(fā)提供指導(dǎo)。

因此，本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)方法建立NF-кB的3D-QSAR藥效團(tuán)模型，運(yùn)用建立的藥效團(tuán)對(duì)毛冬青中所含的76個(gè)小分子化合物的抗NF-кB活性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，從中篩選可能具有抑制NF-кB活性的小分子化合物，為毛冬青制劑在臨床更好地應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持，并為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 數(shù)據(jù)集的建立

從文獻(xiàn)中收集20個(gè)具有抗NF-кB活性的小分子化合物。其中13個(gè)化合物作為訓(xùn)練集，包括雷公藤甲素(T5)[9-10]，羥基苯甲酰-3,4-二氫喹喔啉類化合物4個(gè)(T1-T4)[11]，苯基哌嗪類化合物1個(gè)(T6)[12]，黃酮類化合物4個(gè)(T7-T10)[13]，苯并-γ-吡喃酮類化合物3個(gè)(T11-T13)[14]。選擇7個(gè)化合物建立測(cè)試集，包括羥基苯甲酰-3,4-二氫喹喔啉類化合物3個(gè)(E1-3)[11]，黃酮類化合物3個(gè)(E4-6)[13]，苯并-γ-吡喃酮類化合物1個(gè)(E7)[14]，見圖1。訓(xùn)練集和測(cè)試集按照隨機(jī)和活性梯度原則選取，所有化合物活性均以IC50值表示。從Reaxys(https://www.reaxys.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中收集毛冬青小分子化學(xué)成分共76個(gè)。

圖1 訓(xùn)練集和測(cè)試集化合物分子結(jié)構(gòu)T1-T13為訓(xùn)練集，E1-E7為測(cè)試集

1.2 NF-кB 的3D QSAR藥效團(tuán)模型的構(gòu)建與毛冬青中活性小分子的篩選

將訓(xùn)練集分子三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio(2.5 version)。先用Generate Conformation Protocol 模塊進(jìn)行多構(gòu)象生成，構(gòu)象產(chǎn)生方法設(shè)為“FAST”，其它參數(shù)均為默認(rèn)。然后使用3D QSAR Pharmacophore Generation Protocol 模塊構(gòu)建NF-кB 的3D QSAR藥效團(tuán)模型，根據(jù)訓(xùn)練集分子的結(jié)構(gòu)特征，選擇HB_ACCEPTOR 0 5, HB_DONOR 0 5，HYDROPHOBIC 0 5, RING_AROMATIC 0 5四個(gè)參數(shù)作為需考慮的藥效特征元素，其它參數(shù)均使用默認(rèn)值。

測(cè)試集與訓(xùn)練集通過(guò)Discovery Studio的Build 3D Database 模塊產(chǎn)生構(gòu)象建立數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)為默認(rèn)。通過(guò)Search 3D Database模塊，導(dǎo)入測(cè)試集分子的構(gòu)象，對(duì)藥效團(tuán)的活性預(yù)測(cè)能力進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小、相關(guān)系數(shù)較大的藥效團(tuán)，可認(rèn)為該藥效團(tuán)預(yù)測(cè)能力較好。最后選擇預(yù)測(cè)能力最好的1個(gè)藥效團(tuán)，對(duì)毛冬青中76個(gè)小分子化合物抗NF-кB活性進(jìn)行預(yù)測(cè)，其它參數(shù)為默認(rèn)。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建的NF-кB藥效團(tuán)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力

經(jīng)過(guò)計(jì)算得到10個(gè)藥效團(tuán)模型，見表1。其中藥效團(tuán)1包括1個(gè)氫鍵受體(HBA)，2個(gè)疏水基團(tuán)(HYDROPHOBIC)，1個(gè)環(huán)(RING)，1個(gè)芳香鍵(AROMATIC)；Totalcost為57.5692，使用該藥效團(tuán)對(duì)訓(xùn)練集的13個(gè)化合物進(jìn)行活性預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RMS)為0.3974，相關(guān)系數(shù)R為0.9614，表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相關(guān)性良好，Config值為12.5519，表明該藥效團(tuán)具有較好的預(yù)測(cè)能力，并且預(yù)測(cè)結(jié)果基本可信，見圖2。應(yīng)用7個(gè)化合物組成的測(cè)試集對(duì)該藥效團(tuán)的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性良好，r2為0.9414，見圖3。訓(xùn)練集和測(cè)試集的試驗(yàn)活性和預(yù)測(cè)活性數(shù)據(jù)見表3。

圖2 測(cè)試集實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值線性關(guān)系圖

表1 十個(gè)藥效團(tuán)預(yù)測(cè)結(jié)果表

表2 訓(xùn)練集和測(cè)試集化合物試驗(yàn)活性及預(yù)測(cè)活性表

2.2 從毛冬青中篩選出4個(gè)潛在的NF-кB小分子抑制劑

運(yùn)用建立的藥效團(tuán)模型對(duì)毛冬青中76個(gè)小分子化合物抗NF-кB活性進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出4個(gè)具有潛在活性的小分子化合物，包括美商陸皂苷B(Phytolaccoside B)，冬青苷A(Ilexoside A)，異綠原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)，Sibiricaphenone，IC50值分別為15.99 μM、6.45 μM，15.68 μM和8.06 μM，見表3。圖3為毛冬青中潛在的4個(gè)NF-κB小分子抑制劑與藥效團(tuán)的疊合圖，均有3個(gè)以上的基團(tuán)能與藥效團(tuán)相疊合。圖4為4個(gè)小分子化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。

表3 毛冬青中潛在NF-κB抑制劑名稱及預(yù)測(cè)活性

圖3 毛冬青中潛在NF-κB抑制劑與藥效團(tuán)疊合圖

圖4 毛冬青中潛在活性成分分子結(jié)構(gòu)圖

3 討 論

本研究基于13個(gè)化合物建立了十個(gè)NF-кB的3D-QSAR模型，其中藥效團(tuán)1包括一個(gè)氫鍵受體，兩個(gè)疏水基團(tuán)，一個(gè)芳香基團(tuán)，Totalcost為57.569，相關(guān)系數(shù)R為0.989，Config值為12.129，利用該藥效團(tuán)對(duì)測(cè)試集進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的r2為0.9414。應(yīng)用7個(gè)化合物組成的測(cè)試集對(duì)該藥效團(tuán)的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，r2為0.9414，表明建立的藥效團(tuán)具有良好的預(yù)測(cè)能力。運(yùn)用建立的藥效團(tuán)對(duì)毛冬青中所含的76個(gè)小分子化合物的抗NF-кB活性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，從中篩選出4個(gè)可能具有較好活性小分子化合物，美商陸皂苷B(Phytolaccoside B)，冬青苷A(Ilexoside A)，異綠原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)和Sibiricaphenone。已知NF-кB抑制劑柳氮磺胺吡啶的活性為50.7061 μM，而從毛冬青的化學(xué)成分中篩選出的4個(gè)藥物預(yù)測(cè)的IC50值在6.45～15.99 μM之間，預(yù)測(cè)活性數(shù)據(jù)良好，但是否能作用于NF-кB，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

毛冬青是一種在中國(guó)南方地區(qū)廣泛分布的中藥材，為冬青科植物毛冬青的根或葉，功效為清熱解毒，活血通脈。因其具有良好的抗炎作用，毛冬青在臨床中被用于消除慢性心力衰竭的炎癥狀態(tài)[15]，緩解膝關(guān)節(jié)鏡術(shù)后早期關(guān)節(jié)腫痛與炎癥[16]，以及慢性盆腔炎[17-18]等炎癥性疾病的治療中。以往對(duì)毛冬青中抗炎化學(xué)成分的研究認(rèn)為，毛冬青甲素可通過(guò)促進(jìn)增生性炎癥的轉(zhuǎn)化與吸收，降低血液粘度來(lái)發(fā)揮其抗炎作用[19-20]；毛冬青乙素可以抑制炎癥早期的毛細(xì)血管通透性增加和急性炎癥的滲出、水腫，同時(shí)可降低大鼠腎上腺的VitC含量，因而毛冬青乙素可能是通過(guò)垂體腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)而發(fā)揮其部分抗炎作用[21]。關(guān)于毛冬青與NF-κB之間的聯(lián)系，已有研究表明[22]，用毛冬青提取液對(duì)慢性心力衰竭模型大鼠灌胃，可明顯降低NF-κB的表達(dá)。Escalante A等[23]研究發(fā)現(xiàn)美商陸皂苷B(Phytolaccoside B)具有抗真菌活性，可使霉菌和酵母菌產(chǎn)生畸形，但并不引起紅細(xì)胞溶血，有可能用于真菌感染的治療。劉楊等[24]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)異綠原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)在膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，能明顯抑制NLRP3炎性復(fù)合體在關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)的表達(dá)，并能明顯抑制關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)NF-κB 蛋白表達(dá)及其磷酸化水平，同時(shí)可抑制 NF-κB 抑制蛋白ɑ亞基的磷酸化水平，從而減輕相關(guān)的炎癥反應(yīng)。付運(yùn)星[25]發(fā)現(xiàn)異綠原酸A可顯著下調(diào)感染犬瘟熱病毒(CDV)的狗腎細(xì)胞(MDCK)中IL-Iβ、IL-6、TNF-α、TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平，證實(shí)異綠原酸A可以通過(guò)影響TLR3信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎作用。侯彩平等[26]發(fā)現(xiàn)異綠原酸A在硫酸銅誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥模型中可使斑馬魚體內(nèi)測(cè)線巨噬細(xì)胞數(shù)減少，且減少數(shù)量與異綠原酸A的濃度呈正相關(guān)，表明異綠原酸A有良好的抗炎活性。筆者對(duì)冬青苷A(Ilexoside A)和Sibiricaphenone兩種分子未查找到其相關(guān)藥理作用的研究。

4 結(jié) 論

根據(jù)現(xiàn)有研究資料，本研究篩選出的4個(gè)分子中，異綠原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)有良好的抗炎活性，抗NF-кB作用顯著，可能成為NF-kB抑制藥物。美商陸皂苷B(Phytolaccoside B)、冬青苷A(Ilexoside A)、Sibiricaphenone等三個(gè)分子則有待進(jìn)一步的研究，以驗(yàn)證其與炎癥和NF-кB的聯(lián)系。中醫(yī)藥是偉大的寶庫(kù)，前人對(duì)中藥功效的總結(jié)來(lái)源于臨床實(shí)踐，是直接從大量人體實(shí)驗(yàn)中得出的寶貴結(jié)論，后人將其應(yīng)用于臨床往往行之有效，而其背后的藥物作用機(jī)制則有待我們進(jìn)行深入研究，從中醫(yī)藥治療經(jīng)驗(yàn)中找尋新的藥物顯然是規(guī)避藥物開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一種有效手段。正如日本漢醫(yī)學(xué)家湯本求真在其著作《皇漢醫(yī)學(xué)》中所言：“乃知此學(xué)雖舊，茍能抉其蘊(yùn)奧而活用之，勝于今日之新法多矣。”從大量中醫(yī)藥實(shí)際診療經(jīng)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可能含有有效作用成分的藥物，再結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選初步篩選出活性成分，可以大幅縮小實(shí)驗(yàn)范圍，節(jié)省大量的人力物力，縮短研究周期，降低研究風(fēng)險(xiǎn)，這種研究方法用于藥物開發(fā)的起始階段已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可。