食用香料香蘭素衍生化產(chǎn)物XY201713的抗菌活性及細(xì)胞毒性評價*

陸 靜， 林奇泗

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 徐州 221004;2 徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 徐州 221004)

近年來，食用香料及其修飾產(chǎn)物在抑菌方面的應(yīng)用日益受到重視[1-2]。香蘭素(Vanillin)，又名香草醛，為一種廣泛使用的可食用香料，可在香莢蘭的種子中找到，也可以人工合成[3]。香蘭素對一些細(xì)菌和真菌有不同程度的抑制作用，且具有濃烈奶香氣息[4-5]。當(dāng)前香蘭素被廣泛運用在各種需要增加奶香氣息的調(diào)香食品中，如蛋糕、冷飲、巧克力、糖果；還可用于香皂、牙膏、香水、橡膠、塑料、醫(yī)藥品。此類食用香料的應(yīng)用對減少抗生素濫用和遏制細(xì)菌耐藥性有較為積極的作用[6]。

然而香蘭素在抗菌方面有一定的不足，如鐘少樞等在對比七種單離食用香料的抑菌活性時發(fā)現(xiàn)，香蘭素的抗菌譜較窄，且對大腸桿菌的抑制活性較差[7]。基于香蘭素的結(jié)構(gòu)特性可通過化學(xué)手段將一些活性基團(tuán)引入香蘭素或其衍生物中進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，開發(fā)的新型抗菌劑具有更低的抑菌濃度，更好的抑菌效果。如以香蘭素為原料合成香豆酮和香蘭素衍生物新型席夫堿具有更強的抑菌效果[8-10]。本課題組對香蘭素羥肟酸為原型進(jìn)行了計算機(jī)模擬設(shè)計，合成了一種新型化合物XY201713(圖1)。本研究對該化合物進(jìn)行抗菌活性和細(xì)胞毒性評估，為進(jìn)一步開發(fā)新型食品防腐劑提供研究基礎(chǔ)。

圖1 XY201713的分子結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江省嘉興市俊思儀器設(shè)備廠；AL104電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ZD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DPX-650型電熱恒溫培養(yǎng)箱，沈陽市醫(yī)療器械二廠；VarioskanLUX型全自動酶標(biāo)儀，美國ThermoScientific公司。

1.2 材料與試劑

蛋白胨、瓊脂、牛肉膏，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、葡萄糖，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；卡那霉素(批號：130344-201904)，中國藥品生物制品檢定所；氟康唑(批號：100345-201903)，中國藥品生物制品檢定所；無菌水，徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實驗室自制(臨用前滅菌處理)；RPMI.1640不完全培養(yǎng)基，江蘇省凱基生物技術(shù)股份有限公司；無血清細(xì)胞凍存液，微科曼得生物工程有限公司；藥品XY201713為實驗室自制；乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜均為分析純。

1.3 供試菌種和細(xì)胞

大腸埃希氏菌(ATCC8739)，金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，米曲霉(ATCC42149)和臭曲霉(ATCC14916)由中科院微生物研究所提供。細(xì)菌菌株在37 ℃下Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃下Czapek營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)48 h。

巨噬細(xì)胞系RAW264.7，由中科院上海細(xì)胞庫提供。

2 實驗方法

2.1 抗菌活性試驗

2.1.1 溶液的制備

取藥品XY201713適量，用2%二甲基亞砜(DMSO)溶解定容至最終濃度約為3.0 mg/mL，并用0.45 μm微孔過濾器濾過，作為供試品溶液，臨用前稀釋。

陰性對照溶液為2%DMSO水溶液。

精密稱定卡那霉素、氟康唑?qū)φ掌愤m量，分別加無菌水制成濃度為1.01 mg/mL和1.20 mg/mL的陽性對照品溶液。

2.1.2 抑菌活性的測定

通過圓盤擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性研究。用打孔機(jī)將吸水力強的濾紙制成直徑為6 mm圓片，經(jīng)高壓滅菌后，逐片定量加入供試品溶液、陽性對照溶液和陰性對照溶液各10 μL備用。

取滅菌后的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)瓊脂20 mL，加入0.2 mL菌懸液，倒入平皿，分別制成金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)平板；量取滅菌后的Czapek營養(yǎng)瓊脂20 mL，加入0.2 mL菌懸液，分別制成米曲霉和臭曲霉的真菌培養(yǎng)平板。將含有供試品溶液、陰性對照和陽性對照溶液的濾紙片分別加入細(xì)菌和真菌培養(yǎng)平板表面，每個菌種平行3皿，放入培養(yǎng)箱中，其中，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)菌平板在37 ℃下培養(yǎng)24 h；米曲霉和臭曲霉的真菌平板在28 ℃下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出觀察有無抑菌圈，并測定抑菌圈直徑，mm。

2.1.3 最低抑菌濃度(MIC)測定

取2.1.1項下供試品溶液、陰性對照溶液和陽性對照溶液分別用二倍稀釋法稀釋為一系列不同濃度的提取液后，依次添加到2 mL各種供試菌的菌懸液中。分別取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液10 μL鋪涂至Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)瓊脂中，培養(yǎng)皿在37 ℃培養(yǎng)24 h。取米曲霉和臭曲霉10 μL鋪涂至Czapek營養(yǎng)瓊脂中，培養(yǎng)皿在28 ℃培養(yǎng)48 h。以沒有肉眼可見的細(xì)菌或真菌生長時的提取物最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

2.2 細(xì)胞增殖-毒性檢測

采用CCK8法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長的巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行離心分散后，接種于96孔板中，其中每孔約含有1×104個細(xì)胞，周邊孔中加入PBS以防止邊緣效應(yīng)。待細(xì)胞貼壁后，棄去細(xì)胞上清，同步化處理12 h，周邊孔中仍加入PBS。然后，加入一系列濃度梯度的供試品溶液(0、10、20、30和50 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)。其中每種濃度至少設(shè)置6復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。24 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，于5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出立即于450 nm用酶標(biāo)儀下測定吸光度。

根據(jù)下列公式計算細(xì)胞存活率：

3 結(jié)果與討論

3.1 抑菌活性結(jié)果

XY201713供試品對四種病原菌的抑菌圈大小及最小抑菌濃度見表1。XY201713供試品對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)、大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)、米曲霉(真菌)和臭曲霉(真菌)均有良好的的抑制效果。

表1 XY201713的抗菌活性

破折號(-)表示未檢測。

a.DD表示在抑菌圈直徑，以mm計；b.MIC表示最小抑菌濃度，以mg/mL計。

3.2 細(xì)胞增殖-毒性檢測結(jié)果

為了明確XY201713的毒性作用，檢測了不同濃度下PPC對巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響。如圖2所示，XY201713對RAW264.7的增殖能力影響不顯著，不抑制細(xì)胞的增殖(P>0.05)，結(jié)果表明：在實驗濃度下，XY201713對巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性影響不顯著。

圖2 XY201713對巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

4 結(jié) 論

本研究初步探究XY201713對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、米曲霉和臭曲霉具有一定抑菌活性。同時在實驗濃度下，XY201713對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響不顯著。這提示我們，XY201713對細(xì)胞的安全性較好。

XY201713有一定抑菌活性，同時對細(xì)胞的安全性較好，具有一定開發(fā)潛力。同時，XY201713的其他方面活性還有待于進(jìn)一步開發(fā)研究。