硝基還原酶制備及檢測(cè)*

安亞萱，韓 蕊，王凱悅，王玉彬，毛淑紅，劉 凱，朱柏林

(1天津師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津 300387；2天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

硝基還原酶(NTR)廣泛存在于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌和真核生物中，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，NADPH)存在下，能催化還原多種含硝基芳香化合物，實(shí)現(xiàn)生物體硝基芳香化合物代謝和環(huán)境中芳香族硝基化合物的生物降解[1-2]。生物體內(nèi)NTR 與細(xì)胞缺氧環(huán)境有密切關(guān)系，細(xì)胞缺氧通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NTR含量增加。缺氧是惡性腫瘤產(chǎn)生過(guò)程中普遍存在現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè) NTR 的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體腫瘤細(xì)胞發(fā)展?fàn)顩r的監(jiān)測(cè)，對(duì)臨床治療具有重要意義。因此，NTR檢測(cè)具有重要意義[3-4]。

高活性硝基還原酶制備是NTR熒光探針性能研究的前提，目前，商購(gòu)NTR存在活性不高問(wèn)題。本文優(yōu)化了NTR制備方法，獲得了高活性NTR；合成了NTR熒光探針1，研究探針1與NTR作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光探針1對(duì)NTR是敏感的，隨NTR含量增大，探針熒光強(qiáng)度增大，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本工作為NTR制備及其熒光探針研究提供了有益的素材。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

FS5熒光分光光度計(jì)，Edinburgh儀器公司；核磁波譜儀(400M Hz)，Buker公司。

菌株E.coliK12，E.coliBL21和質(zhì)粒pET28a于天津科技大學(xué)應(yīng)用微生物與酶工程實(shí)驗(yàn)室保存；NADH購(gòu)自Sigma Chemical；2,4-二甲基吡咯、3,4-二硝基苯甲酸等化學(xué)試劑均為中國(guó)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析級(jí)化學(xué)試劑。

1.2 硝基還原酶NfsB目的基因的擴(kuò)增

1.2.1 PCR擴(kuò)增

按照NCBI中E.coliK12菌株中，NfsB的基因序列，將引物的序列設(shè)計(jì)如下：

NfsB-Forward：GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG

NfsB-Reverse：GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT

以NfsB-F和NfsB-R為引物，利用PCR將目的基因擴(kuò)增。在擴(kuò)增產(chǎn)物的5′末端添加限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物的3′末端添加限制性?xún)?nèi)切酶NdeI的酶切位點(diǎn)。之后利用電泳檢測(cè)并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)采用EcoRI和NdeI兩種酶對(duì)載體質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，具體酶切體系如表1所示。酶切結(jié)束后，根據(jù)目的基因和載體質(zhì)粒摩爾比為2:1于16 ℃過(guò)夜連接，如圖表2所示。

表1 載體質(zhì)粒雙酶切體系

表2 雙酶切片段連接體系

1.3 基因工程菌株的構(gòu)建

1.3.1 E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞制備及目的基因轉(zhuǎn)化

將混合好質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞冰浴20 min后，在42 ℃進(jìn)行90 s熱激，再進(jìn)行2 min的冰浴。添加500 μL不含抗生素LB培養(yǎng)基，37 ℃環(huán)境中進(jìn)行1 h的培養(yǎng)。離心后取適量菌液涂布平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。將經(jīng)PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，之后進(jìn)行質(zhì)粒提取，并通過(guò)酶切驗(yàn)證。

1.3.2 NfsB的誘導(dǎo)表達(dá)

取10 mL種子培養(yǎng)液，按2%接種規(guī)格，將其轉(zhuǎn)接到30 mL LB液體培養(yǎng)基中，添加200 μL卡那霉素，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為 60 μg/mL，于37 ℃培養(yǎng)3 h，添加20 μL 2 M IPTG溶液，之后將溶液置于16 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 NfsB的分離純化

培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4 ℃ 8000 r/min離心10 min，去上清，加入30 mL細(xì)胞裂解緩沖液，對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行重懸。加300 μL溶菌酶后，進(jìn)行菌體超聲破碎，于4 ℃ 12000 r/min離心30 min。采用鎳柱親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并通過(guò)SDS-PAGE對(duì)目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 NTR濃度測(cè)定及酶活檢測(cè)

利用Brandford法測(cè)定蛋白濃度。基于NADH在340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化來(lái)測(cè)量NTR還原活力[1]。

圖1 探針1的合成路線

1.6 氟硼吡咯探針的制備

Ar保護(hù)下，取3,4-二硝基苯甲酰氯(2.3 g，10 mmol)和2,4-二硝基吡咯(1.90 g，20 mmol)于三口燒瓶，室溫反應(yīng)3天，反應(yīng)體系顏色為生深紅色。加入5 mL無(wú)水三乙胺15 min后，再加6 mL 47%三氟化硼乙醚，繼續(xù)反應(yīng)1天，猝滅反應(yīng)，萃取，減壓蒸除有機(jī)溶劑，經(jīng)柱色譜分離得紅色探針1(1.55 g， 40%)[5]。1H NMR(400 MHz，CDCl3) δ:1.43 (s, 6H，-CH3), 2.57 (s, 6H，-CH3), 6.06(s, 2H，pyrrole-H), 7.75-8.15 (m, 3H，Ar-H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ:14.9, 15.4, 122.4, 125.5, 126.1, 130.5, 133.4, 134.8, 141.8, 142.1, 142.3, 143.6, 157.8. FAB-MS:found 415.82, calcd for[M+H]+, 415.14。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒NfsB-pET28a構(gòu)建

根據(jù)目的基因序列和酶切位點(diǎn)要求，按照引物設(shè)計(jì)原則分別構(gòu)建了引物NfsB-pET28a-F和NfsB-pET28a-R。在實(shí)驗(yàn)中，以硝基還原酶NfsB目的基因?yàn)槟０澹詐ET28a質(zhì)粒為目標(biāo)載體，利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增產(chǎn)物3′末端載入限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5′末端載入內(nèi)切酶Nde I酶切位點(diǎn)。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2(a)所示。PCR條帶與NCBI檢索的目的基因大小(654 bp)一致[6]。載體酶切驗(yàn)證如圖2(b)顯示，pET28a基因大小為5369 bp，表明酶切正確。之后的菌群PCR驗(yàn)證證明菌體PCR驗(yàn)證條帶是正確條帶(圖2(c))。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，重組質(zhì)粒NfsB-pET28a構(gòu)建完成目的基因片段正確，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 (a)NfsB基因的PCR結(jié)果(M：10KB標(biāo)準(zhǔn)DNA；1-2：NfsB基因)；(b)pET28a載體酶切圖(M：10KB標(biāo)準(zhǔn)DNA；1-2：pET28a基因)；(c)菌群PCR驗(yàn)證(M：10KB標(biāo)準(zhǔn)DNA；1：轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證)

2.2 NTR的表達(dá)與純化

重組NfsB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)，如圖3所示，在分子量大約為23 kDa的地方能觀測(cè)到一明顯的誘導(dǎo)條帶，與NCBI中檢索得到的蛋白分子量23.9059 kDa結(jié)果一[7]；通過(guò)Brandford法測(cè)定蛋白濃度9.549 mg/mL，與文獻(xiàn)查閱所得基本一致[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白表達(dá)量濃度純度相對(duì)較高，已獲得了目標(biāo)蛋白，可作為標(biāo)品用于下一步NTR熒光探針性能表征。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1-上清蛋白樣;2-沉淀蛋白樣;3-流出液蛋白樣;4-wash buffer蛋白樣;5-加入wash buffer后樹(shù)脂吸附蛋白樣;6-洗脫液蛋白樣;7-加入洗脫液后樹(shù)脂吸附蛋白樣

2.3 NTR酶活分析

NADH存在下，利用NTR催化還原對(duì)硝基苯酚為對(duì)氨基苯酚測(cè)定其酶活，是NTR活性檢測(cè)的重要方法之一[1]。配置不同濃度NADH(0～0.16 mM)于PBS緩沖液中，加入適量NTR和對(duì)硝基苯酚。于37 ℃下，測(cè)定340 nm吸光度。據(jù)此擬合得到NADH消耗量與吸光度之間關(guān)系，即A=3.406[NADH]+ 0.0714 (R2=0.998)，如圖4所示，據(jù)此可計(jì)算出體系每反應(yīng)100 μL NTR消耗0.008 mM的NADH。根據(jù)酶活計(jì)算公式：

圖4 NADH的標(biāo)準(zhǔn)曲線

U=(D×EW×V×103)/(6220×l×Vs)

其中：D為稀釋倍數(shù)，EW為1 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化；V為反應(yīng)液的體積(mL)；6220為摩爾消光系數(shù) (L mol-1cm-1)；L為光程距離(cm)，Vs為酶液體積。

可得酶活U=163.34 U/mL[8]。

2.4 探針1與NTR含量關(guān)系

研究中固定探針1濃度為3×10-5M、改變NTR濃度(0～ 3 μg/mL)，于37 ℃ pH=7.4 PBS緩沖液中測(cè)定其520 nm熒光強(qiáng)度。如圖5所示，隨NTR含量增加，熒光強(qiáng)度逐漸增大；在NTR濃度范圍為0.2～2.0 μg/mL，熒光強(qiáng)度與其呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，據(jù)3σ/slop[9]可確定其檢測(cè)限為15 ng/mL。

圖5 化合物1熒光強(qiáng)度和NTR含量關(guān)系

3 結(jié) 論

本文通過(guò)基因工程菌制備并純化NTR，利用其對(duì)對(duì)硝基苯酚催化還原能力確定了NTR活性。結(jié)合氟硼吡咯類(lèi)熒光探針研究，構(gòu)建了可被NTR還原的含雙硝基的氟硼吡咯化合物1，考察了識(shí)別過(guò)程中熒光強(qiáng)度與NTR含量關(guān)系，隨NTR含量增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，其數(shù)值與NTR含量具有較好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1可作為NTR探針使用，本工作為NTR識(shí)別與傳感研究提供了有益素材。