柱切換-高效液相色譜法與均相酶免法檢測艾司西酞普蘭血藥濃度的比較研究

馬睿婷 于利國 鄭蘭兵

(內(nèi)蒙古自治區(qū)精神衛(wèi)生中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

艾司西酞普蘭于2002年獲FDA批準在美國上市，2006年進入我國精神科市場，對重度的抑郁癥和焦慮癥有顯著療效，受到精神科臨床醫(yī)生的關(guān)注，迅速成為抗抑郁的首選藥物之一[1]。艾司西酞普蘭雖療效好，但由于治療窗窄，患者的個體差異也較大，抗抑郁作用與患者血藥濃度顯著相關(guān)[2-4]。低于有效血藥濃度值的患者可能無法起到治療作用，而超過有效血藥濃度會產(chǎn)生口干、惡心、嗜睡、出汗增多、頭痛、癲癇或激素紊亂等副作用[5-8]。目前測定艾司西酞普蘭濃度的方法較多，柱切換高效液相色譜法[9]采用在線聚焦樣品，克服樣品轉(zhuǎn)移過程中的非正態(tài)損失，樣品同向轉(zhuǎn)移傳輸，進入液相色譜以進行血藥濃度的檢測。均相酶免法(HEI)是一種具有酶特異性的方法，用高特異性和強催化活力的酶來測定人體液中微量的藥物及內(nèi)源性物質(zhì)。本文通過對柱切換高效液相色譜法和均相酶免法[10，11]測定人血清中艾司西酞普蘭方法的研究，對比分析兩種方法的差異及影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津高效液相色譜(LC-20AT含consence數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津公司)；臺式離心機(TGL-16 CENCE，湖南湘儀離心機儀器有限公司)；電子天平(AUW120D,日本島津)；漩渦混合器(VORTEX-5 KYLINBELL，北京中西遠大科技有限公司)；全自動生化分析儀。艾司西酞普蘭對照品(批號：20191001)；艾司西酞普蘭質(zhì)控品(批號：20191011)；艾司西酞普蘭定標液(批號：20191021)；艾司西酞普蘭試劑(批號：20191031)；甲醇、乙腈為色譜純。

1.2 標本資料

來自2018年1—12月本院住院和門診患者的艾司西酞普蘭檢測標本，共60份。將分離血清分為2份。

1.3 方法

1.3.1 柱切換-高效液相色譜法(Column-switching, CS)

在線柱切換HPLC檢測血清中藥物的濃度，Column-switching的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)見圖1。圖1a中，六通閥(6-port valve)位置A時，全血離心后，血清樣品直接進樣Auto-sampler，混合流動相C攜帶樣品進入系統(tǒng)，稀釋后的樣品由D相稀釋后帶入MAYI Column，吸附血清中的藥物分子，大分子蛋白質(zhì)由廢液流出，切換六通閥，切換后如圖1中的b圖，混合流動相AB，反相洗脫MAYI柱，將保留在MAYI柱上的藥物洗脫下來，Column-C18分離，檢測器檢測。

(a)

1.3.1.1 專屬性實驗

在優(yōu)選后的色譜條件下，分別對艾司西酞普蘭對照品、艾司西酞普蘭樣品血清、空白血清進行測定，得到專屬特征峰，確定艾司西酞普蘭保留時間為8.0 min，空白血清無此峰。

1.3.1.2 標準曲線的制備

標準溶液制備：精密稱取ES對照品1 mg，用5 mL 70%甲醇溶解，稀釋至刻度，定容于10 mL量瓶，得0.1 mg·mL-1的艾司西酞普蘭對照品溶液。

空白血清采自健康體檢人員，混合血清各450 uL，精密加入配好的ES標準曲線溶液0.1，0.2,0.4,0.8,1.6 μg·mL-1艾司西酞普蘭標準溶液50 μL，配制濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg·mL-1的梯度標準溶液。取空白血清樣品500 ul，置10 mL具塞試管中，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。取20 uL進樣，取柱切換色譜條件下測定峰面積，繪制標準曲線。曲線表明：艾司西酞普蘭濃度為0.01～0.16 μg·mL-1時，峰面積與ES血清濃度呈有良好的線性，方程式:y=2 147.607x-9.142 46，r=0.999 4，最低檢測限(S/N=3)為3.2 ng·mL-1。

1.3.1.3 精密度

配制0.1、0.4、1.6 μg·mL-1三個梯度濃度的艾司西酞普蘭標準質(zhì)量控制5份并進行處理，按照“1.3.1”項下色譜法進樣，在1日平行測5次，精密度日內(nèi)RSD為2.3%，表明精密度良好。

1.3.1.4 重復性

精密配置0.4 μg·mL-1艾司西酞普5份空白血清樣品，按照“1.3.1”項下色譜法進樣，采用Column-switching分析，RSD為1.7%，表明該法重復性良好。

1.3.1.5 穩(wěn)定性

配制含有1.6 μg·mL-1濃度的艾司西酞普蘭標準血清樣品，按照“1.3.1”項下色譜法進樣，于固定時間點測定(0、2、4、8、12、24h)。

1.3.1.6 方法回收率

配制2、8、12 μg·mL-1三個濃度水平的艾司西酞普蘭自配標準血清樣品，各濃度加入已配舒樂安定標準溶液適量，按照“1.3.1”項下色譜法進樣，測定，得回收率即實際含量/理論加入含量，艾司西酞普蘭血清加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，加樣回收率在80.2%～83.7%之間，回收率符合《中國藥典》關(guān)于生物樣品的測定要求，表明該法準確可靠。

1.3.2 均相酶免法

均相酶免法整個反應發(fā)生在一個液相均相體系中，酶免反應萄糖六磷酸脫氫酶-艾司西酞普蘭偶聯(lián)物和血漿蛋白中抗艾司西酞普蘭特異性抗體位點上。樣本中游離的艾司西酞普蘭越多，競爭性位點越多，抗體釋放出的酶標偶聯(lián)物就越多。游離出來的艾司西酞普蘭酶標偶聯(lián)物催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型NADH，樣本中的艾司西酞普蘭濃度與NADH的生成量成正比，通過生化儀器紫外檢測器測得其340 nm處的吸光值的變化即可計算出艾司西酞普蘭的含量。

1.3.3 分析與統(tǒng)計

分析柱切換-HPLC法和HEI發(fā)測定結(jié)果的差異。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度測定結(jié)果

對門診60例服用艾司西酞普蘭的患者進行血藥濃度監(jiān)測，單藥服用，其中男19例，女41例，年齡15～75歲。對同一樣本在同一天分別采用柱切換-HPLC法和HEI法進行對比測定。HEI法采用貝克曼AU-5800進行測定，柱切換-HPLC按照“1.3.1”項下方法進行測定，測定結(jié)果見表1。

表1 60例患者艾司西酞普蘭血藥濃度測定結(jié)果對比

從表1中可以看出，監(jiān)測結(jié)果在有效血藥濃度范圍內(nèi)占43.33%，3例患者出現(xiàn)輕微的副反應，但是仍然有一部分患者的檢測結(jié)果不在有效范圍內(nèi)。根據(jù)我們對精神科藥物的長期監(jiān)測經(jīng)驗，當患者血藥濃度控制在有效血藥濃度范圍，癥狀控制較好，而低于或高于有效血藥濃度的患者，抑郁癥時好時壞，容易反復發(fā)作。

2.2 兩種方法檢測的相關(guān)性評價

以均相酶免法測定的結(jié)果為Y，以柱切換-高效液相色譜法測定結(jié)果為X，進行線性回歸，方程為：Y=0.921 9X+0.050 1(n=60,r=0.899 9)；將均相酶免法測定結(jié)果和柱切換-高效液相色譜法測定結(jié)果進行T檢驗，其結(jié)果在統(tǒng)計學上無差異(P>0.05)。經(jīng)過比對差異不顯著，但是均相酶免法測定的結(jié)果相對于柱切換-高效液相色譜法相對較低，究其原因為，均相酶免法在試劑的準備中需要溫度的控制，酶的活性溫度為37 ℃，所以在試劑進入機器檢測前，試劑的準備尤為重要，而且均相酶免法需要生化儀器設(shè)備來完成，定標和質(zhì)控的價格昂貴，有效期限短。相反，柱切換-高效液相色譜法測定艾司西酞普蘭的血藥濃度操作簡單，也無需對血清進行預處理，試劑成本低，方法穩(wěn)定，檢測器本身能夠?qū)崿F(xiàn)對樣本中藥物小分子的檢測，故能滿足檢驗科日常監(jiān)測工作。

3 討論

本研究采用柱切換HPLC法測定人血漿中艾司西酞普蘭的血藥濃度，該法具有很高的靈敏度和專屬性。均相酶免法測定的艾司西酞普蘭的血藥濃度是葡萄糖六磷酸脫氫酶-艾司西酞普蘭偶聯(lián)物抗體位點競爭性結(jié)合的產(chǎn)物，酶的活性、底物的活性都會影響檢測結(jié)果，具有很高的特異性。柱切換-HPLC系統(tǒng)檢測血藥濃度在線聚集樣品，減少樣品前處理的損失，樣品進入液相采用柱切換技術(shù)同向處理除去蛋白，可以防止分析柱的堵塞，從而具備良好的耐受性及可定量性，樣品處理簡單、結(jié)果準確度高和自動化程度高等，該技術(shù)適用于精神科藥物的血藥濃度監(jiān)測[5-7]。

均相酶免分析方法借助生化分析儀，其測定速度快、測定結(jié)果準確、測定過程和柱切換高效液相法一樣不需前處理血清樣品，經(jīng)過定標、質(zhì)控后，2 min內(nèi)即可出結(jié)果，試劑具有一定的穩(wěn)定性，操作過程簡便，數(shù)據(jù)處理過程已經(jīng)量化，無需計算[8,9]。但是HEI方法靈敏度對于有些藥物不能夠準確檢測，測定時定標、質(zhì)控都對樣品溫度和檢測溫度有一定的要求，反應終點難于嚴格要求，同時均項酶免法對于精神科藥物的血藥濃度檢測試劑價格昂貴，檢測成本過高，不利于臨床檢驗，有待進一步改進[12-15]。

兩種方法檢測艾司西酞普蘭血藥濃度的檢測結(jié)果均可為臨床提供可靠的檢測結(jié)果，艾司西酞普蘭差異直接影響臨床醫(yī)師的用藥和個體治療，兩者檢測結(jié)果相近，對檢測結(jié)果有驗證的作用，在臨床應用中柱切換高效液相色譜法特異性和專一性強，較HEI法實用性強一點，能夠滿足艾司西酞普蘭的臨床檢測。患者在一個用藥周期內(nèi)監(jiān)測艾司西酞普蘭血藥濃度應采用同一種方法，以便為臨床提供精準的個體檢測結(jié)果。