四川老鷹茶醇提物的抑菌及抗氧化活性研究

李宇航，蘭 林，謝 玲，錢葉遷，李玉鋒

西華大學，四川 成都 610039

老鷹茶，又稱白茶、老蔭茶、老人茶等，由毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl Var.lanuginose(Migo)Yang et P. H. Huang）的嫩芽葉或枝葉加工制成，是我國西南地區(qū)長期飲用的一種植物代茶[1-2]。有關老鷹茶的歷史記載最早于乾隆十一年（1746年）的《犍為縣志》，此后的《丹棱縣志》《城口廳志》《合川縣志》《蒼溪縣志》等方志中均有記載[3-4]。2012年，原國家質(zhì)檢總局批準對石棉縣6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的老鷹茶實施地理標志產(chǎn)品保護[5]。老鷹茶茶湯呈琥珀色，香氣芳香和樟香，滋味醇和、回甘，具有消渴祛暑、止咳化痰及健胃開脾等功效，且無毒副作用[6-7]。

研究表明，老鷹茶的主要生物活性物質(zhì)是多酚類與黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、降血糖和抗癌等作用[8-9]。目前，關于四川不同地區(qū)老鷹茶醇提物的總多酚和總黃酮含量及其抑菌和抗氧化活性強弱的對比未見研究報道。本試驗研究以四川3個不同產(chǎn)地的老鷹茶及老鷹茶植物的鮮葉為原料，采用超聲波輔助提取技術(shù)分離提取富含多酚與黃酮的醇提物，分別測定多酚和黃酮含量及其抑菌和抗氧化能力，旨在為老鷹茶資源的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種及培養(yǎng)基

供試菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）、枯草芽孢桿菌（Baci llus subtilis，CMCC（B）63501）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae，CMCC（B）51105）和大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922），均購自中國科學院微生物研宄所菌種保藏中心；所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試驗材料

老鷹茶，分別購買自四川省雅安市石棉縣、廣元市青川縣和宜賓市敘州區(qū)農(nóng)茶商；老鷹茶鮮葉，2020年4月分別采摘自雅安市石棉縣、廣元市青川縣和宜賓市敘州區(qū)的農(nóng)商茶園。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品醇提物的制備

將3種茶葉和3種鮮葉分別于40℃烘干，粉碎，過40目篩；稱取50 g干粉，以70%乙醇水溶液為提取溶劑，超聲功率300 w、料液比1 g∶50 mL、溫度60℃下浸提60 min，過濾；重復提取兩次，合并提取液。于60℃減壓濃縮得浸膏，置于真空冷凍干燥機干燥，得6種樣品醇提物干粉[10]。

1.2.2 樣品醇提物提取率計算[11]

1.2.3 多酚含量測定

依照GB/T 8313—2018的福林酚比色法[12]測定。

1.2.4 黃酮含量測定

依照王宗成等[13]的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定其中黃酮總量。

1.2.5 抑菌活性測定

取適量乙醇提取物加乙醇溶解，配成濃度分別為100 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL的樣品溶液。采用牛津杯法[14]測定6種樣品醇提物的抑菌圈直徑。4種細菌接種活化后用無菌生理鹽水把菌懸液濃度稀釋到1.0×108CFU/mL。將營養(yǎng)瓊脂加至培養(yǎng)皿中，吸取0.2 mL菌懸液加入培養(yǎng)基涂布均勻，將涂布好的培養(yǎng)皿分為4個區(qū)域（提取液濃度分別為100 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL，等體積乙醇為對照），每個培養(yǎng)皿等距離放置 4個牛津杯，注入各個濃度的樣品液200 uL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑[15]。

1.2.6 DPPH自由基清除率測定

參照Hatano[16]測定DPPH自由基清除能力方法并稍作修改。稱取一定量的DPPH用無水乙醇配制成2×10-4mol/L DPPH溶液。準確量取2 mL不同樣品提取液和2 mL DPPH溶液混合均勻，黑暗中反應30 min，3500 r/min離心10 min，取上清液于517 nm處測定吸光值。以BHT作為陽性對照，其計算公式如下：

式中，A0為無水乙醇和DPPH溶液的吸光值；A1為提取液和DPPH溶液的吸光值；A2為提取液和無水乙醇溶液的吸光值。

1.2.7 總還原能力測定

參照Vaquero[17]測定總還原力方法并稍作修改。在10 mL離心管中分別加入0.2 mol/L pH值6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和不同樣品提取液1 mL，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50℃反應20 min。取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應，3500 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 1%三氯化鐵，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光值。以蒸餾水為空白對照，BHT作為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次，取平均值，以X±SD表示；采用SPSS 24.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，通過單因素方差分析的Duncan’s法進行差異性顯著分析，顯著性水平設定為0.05。繪圖采用Origin 9.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品醇提物提取率

表1結(jié)果表明，除石棉老鷹茶和敘州老鷹茶差異不顯著外，其余樣品之間差異顯著（P< 0.05）。其中青川老鷹茶的提取率最低，為（19.72±0.47）%；石棉老鷹茶鮮葉的提取率最高，為（26.73±0.68）%。老鷹茶鮮葉的提取率普遍高于老鷹茶。

表1 樣品醇提物提取率Table 1 Extraction rate of ethanol extract of the samples

2.2 多酚及黃酮總量

根據(jù)沒食子酸的濃度擬合回歸方程為Y=0.0123x + 0.0025、R2= 0.9992和蘆丁的擬合回歸方程為Y= 0.0131x + 0.0265、R2= 0.9993，可見具有良好的線性關系。由圖1可知：6種樣品的多酚含量差異顯著，其中石棉老鷹茶鮮葉多酚含量最高，為（22.1±0.11）%；含量最低的是青川老鷹茶，為（16.24±0.17）%。黃酮含量測定結(jié)果中，除石棉老鷹茶分別與敘州老鷹茶和青川老鷹茶鮮葉差異不顯著外，其他樣品之間均差異顯著；其中石棉老鷹茶鮮葉黃酮含量最高，為（16.77±0.14）%；含量最低的是青川老鷹茶，為（13.84±0.55）%。老鷹茶多酚和黃酮含量明顯低于鮮葉，原因可能是在加工過程中造成了一定的損失[18]。

圖1 樣品醇提物總多酚和總黃酮含量Figure 1 Contents of total polyphenols and total flavonoids in the ethanol extract of the samples

2.3 抑菌效果

采用牛津杯法測量抑菌圈大小，結(jié)果顯示：在不同濃度（100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL）下，6種樣品醇提物均對實驗中的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌和大腸桿菌具抑菌活性，說明老鷹茶和老鷹茶鮮葉有著廣譜的抑菌作用（表2）。

表2 不同濃度樣品醇提物對細菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of ethanol extracts of the samples with different concentrations on bacteria

在所有樣品醇提物中，石棉老鷹茶鮮葉對4種細菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑在1.69 ～2.56 cm；其次為敘州老鷹茶鮮葉，抑菌圈直徑在1.58 ～ 2.48 cm；對細菌抑制作用最弱的為青川老鷹茶，抑菌圈直徑在0.95 ～ 2.14 cm。6種樣品醇提物對痢疾志賀氏菌的抑制效果最好，其次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，且隨著提取液質(zhì)量濃度的增加抑制效果增強。其他實驗表明，老鷹茶總黃酮提取物除對大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌無明顯作用外，對供試的金黃色葡萄球菌與枯草桿菌等均表現(xiàn)出一定的抑菌效果[19]。綜上，6種樣品醇提物對4種細菌的抑制作用從強到弱排列為石棉老鷹茶鮮葉 > 敘州老鷹茶鮮葉 > 青川老鷹茶鮮葉 > 石棉老鷹茶 > 敘州老鷹茶 > 青川老鷹茶。

2.4 對DPPH自由基的清除作用

由表3可知：除敘州和青川老鷹茶DPPH自由基清除能力的IC50值差異不顯著外，其余差異顯著（P< 0.05）。6種樣品醇提物的DPPH清除能力均高于陽性對照BHT，均可作為天然抗氧化劑的優(yōu)質(zhì)來源。其中，DPPH自由基清除能力的IC50值最高的為青川老鷹茶，為（9.95±0.39）μg/mL；最低的為石棉老鷹茶鮮葉，為（8.16 ±0.08）μg/mL。三種老鷹茶的DPPH自由基清除能力的IC50值均高于三種老鷹茶鮮葉，由此可見老鷹茶鮮葉的抗氧化能力更強。比較DPPH自由基清除率能力，由強至弱的順序為石棉老鷹茶鮮葉 > 敘州老鷹茶鮮葉 > 青川老鷹茶鮮葉 > 石棉老鷹茶 > 敘州老鷹茶 > 青川老鷹茶 > BHT。

表3 樣品醇提物對DPPH自由基的清除作用Table 3 Scavenging effect of ethanol extract of the samples on DPPH radical

2.5 總還原能力

由圖2可知：6種樣品醇提物和對照品BHT的總還原能力通過吸光度值進行比較，還原能力均隨著濃度的增加而增加。石棉老鷹茶鮮葉在6個濃度中均比另外5種樣品醇提物的吸光度值高，并且6種樣品醇提物的吸光度值均高于陽性對照BHT；石棉老鷹茶鮮葉的總還原能力最強，其次是敘州老鷹茶鮮葉的總還原能力較強。3個地區(qū)的老鷹茶比較，石棉老鷹茶總還原能力最強，青川老鷹茶總還原能力最弱。總還原能力由強到弱的順序為石棉老鷹茶鮮葉>敘州老鷹茶鮮葉>青川老鷹茶鮮葉>石棉老鷹茶>敘州老鷹茶>青川老鷹茶>BHT。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是生物活性物質(zhì)含量的差異影響著它們的還原能力，進而影響抗氧化能力，因為茶多酚是茶葉中重要的抗氧化物質(zhì)[20]。

圖2 樣品醇提物的總還原能力Figure 2 Total reduction capacity of ethanol extract of the samples

3 討論

通過對石棉老鷹茶、青川老鷹茶、敘州老鷹茶及石棉老鷹茶鮮葉、青川老鷹茶鮮葉、敘州老鷹茶鮮葉醇提物的提取得率與醇提物中多酚及黃酮總含量的測定，以及醇提物抑菌活性和抗氧化活性研究比較發(fā)現(xiàn)，6種醇提物中，石棉老鷹茶鮮葉的提取率（26.73±0.68）%最高，多酚含量最高，為（22.10±0.11）%，黃酮含量（16.77±0.14）%也最高；石棉老鷹茶鮮葉對DPPH自由基清除作用及總還原能力最強。6種樣品醇提物分別對4種細菌有一定抑制作用，其中石棉老鷹茶鮮葉對痢疾志賀氏菌的抑制效果最好，其抑菌圈直徑為2.56 cm。試驗研究結(jié)果表明，四川6種老鷹茶的醇提物具有不同的抑菌活性和抗氧化活性，其活性與多酚及黃酮含量存在一定相關；石棉老鷹茶鮮葉多酚和黃酮含量較高，抑菌活性和抗氧化活性較好。可見，老鷹茶在代茶植物開發(fā)中具有較廣闊的應用前景。