EGCG通過PI3K-AKT信號通路調控FOXO1磷酸化抑制3T3-L1前脂肪細胞分化

羅江瓊，陳紫君，李延明，袁林穎，周四明，龐 科，張 瑩,*

1. 重慶醫(yī)科大學 附屬永川醫(yī)院，重慶 402160；2. 重慶市農業(yè)科學院 茶葉研究所，重慶 402160

能量攝入與消耗不平衡會引起脂肪的增加，最終導致肥胖[1]。在現(xiàn)代社會中，由于高脂肪、高熱量的飲食和久坐不動的生活方式，超重以及肥胖癥患者數(shù)量不斷增加[2-3]，肥胖引起的胰島素抵抗、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的病發(fā)率逐年升高[4-5]。近年來的研究表明，脂肪組織不僅是提供能量貯備的終末分化器官，也是一種內分泌器官[6]。脂肪組織能夠分泌多種具有生物活性的多肽，這些多肽被稱為脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素與抵抗素等[7-10]。脂肪因子通過自分泌和旁分泌途徑調控脂肪細胞的分化、代謝以及局部炎癥反應，并且在胰島素耐受性和慢性炎癥過程中起到重要作用[11-12]。

EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）是綠茶的主要有效成分，在抗氧化活性、抗血管生成、抗腫瘤、心血管保護和血脂調節(jié)等方面有重要作用[13-17]。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)EGCG有抑制脂肪生成的作用。早在2002年，Prusty等[18]發(fā)現(xiàn)EGCG能夠促進脂肪細胞凋亡從而抑制脂肪的生成。同時有研究證實，EGCG可通過抑制脂質積累以及激活脂肪酸生物合成限速酶和乙酰輔酶a羧化酶來抑制脂肪細胞的分化[19]。Wolfram等發(fā)現(xiàn)，100 μM的EGCG能夠顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖[20]。Liu等研究證實，EGCG可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路的細胞外信號相關激酶（ERKs）抑制3T3-L1脂肪細胞分化和抵抗素基因的表達[21]。

“Forkhead”，即叉頭蛋白轉錄因子，蛋白質超家族的一種。哺乳動物的FOXO蛋白屬于叉頭蛋白家族的“O”亞家族[22]，F(xiàn)OXO家族成員包括FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6等[23]。轉錄因子FOXO1作為AKT通路下游信號之一，在許多動物組織中都高度表達，包括參與細胞增殖與分化、誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯性、DNA修復、發(fā)育分化及糖代謝等[24-27]生理作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXO1也參與了脂肪細胞分化的調控，F(xiàn)OXO1通過與啟動子激活受體γ（PPARγ）結合從而抑制PPARγ的轉錄活性影響脂肪形成[30]。哺乳動物的FOXO1轉錄因子有三個高度保守的磷酸化位點，Thr24、Ser256 與Ser319[31]。FOXO1表達受到PI3k/AKT信號通路磷酸化調控，當PI3K/AKT信號通路被激活時磷酸化的FOXO1蛋白結合在14-3-3蛋白位點上被運輸?shù)郊毎|，其轉錄功能受到抑制[32]。Kim等研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過失活FoxO1和SREBP1c抑制脂肪細胞分化，之后他們又發(fā)現(xiàn)EGCG可通過胰島素信號通路以及MAPK信號通路導致FOXO1轉錄失活從而抑制脂肪細胞分化。

本試驗通過添加不同濃度外源EGCG，研究EGCG對前體脂肪細胞分化的影響，并探討其影響的分子作用機制，以期為EGCG防治肥胖發(fā)生提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-L1小鼠前脂肪細胞購買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

EGCG（純度90%），購于海富生物工程有限公司；I型膠原酶、胰蛋白酶，購于Sigma公司；紅細胞裂解液、油紅O，購于Solarbio；DMEM/F12、PBS（無鈣、鎂），購于Hyclone公司；FOXO1、P-FOXO1、PPARγ、FAS、β-actin抗體，購于Abcam公司；胎牛血清、RNA抽提試劑Trizol、RNase-free-ddH2O、氯仿、無水乙醇、異丙醇等國產分析純，購于天根生化科技有限公司。

主要試劑盒為 SYBR Prime Script TMRTPCR Kit與Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser，購于寶生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化

根據(jù)鄭國棟等[34]的試驗方法，將3T3-L1前脂肪細胞以2×104個/孔接種至6孔板中，用DMEM完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液。當3T3-L1前脂肪細胞融合率達到90%時，分別在含有不同濃度（0 μM 、5 μM、 10 μM、5 0 μM、100 μM）EGCG的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導8 d。提取總RNA和總蛋白進行RT-qPCR及Western blot檢測。

1.3.2 油紅O染色法檢測細胞脂質含量

分化后的3T3-L1前脂肪細胞在含有不同濃度（0 μM、5 μM、10 μM、50 μM、100 μM）EGCG培養(yǎng)8 d后用于油紅O染色，染色方法參照Zhong、Jeong等[35-36]。細胞用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min，接著再用PBS洗3次，并晾干20 min。油紅O染色細胞，蘇木精復染，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 RT-qPCR檢測

將細胞樣提取總RNA并反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR檢測。各基因引物由引物設計軟件Primer 5設計。退火溫度（Tm）通過跑梯度PCR獲得，各基因引物的序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences of qPCR

1.3.4 Western blot分析

參照史新娥等[37]的試驗方法提取細胞總蛋白。利用Bradford法測定其濃度，并進行SDSPAGE凝膠電泳。目的條帶轉至PVDF膜上，孵育一抗（1∶2000），4℃過夜。接著孵育二抗（1∶4000），以β-actin作為內參。最后用Bio-Rad GS-800曝光目的蛋白，并利用Quantity One分析蛋白相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，Duncan’s法進行多重比較，以P< 0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EGCG對前脂肪細胞分化的影響

如圖1所示，在 5 μM、10 μM、50 μM、100 μM的EGCG分別誘導8 d后，3T3-L1細胞出現(xiàn)大量脂滴。隨著EGCG濃度增加，脂滴數(shù)量逐漸減少。其中，100 μM組中的脂質含量最低，與5 μM組脂質含量差異極顯著（p< 0.01）。結果表明，EGCG抑制3T3-L1前脂肪細胞分化，阻礙脂質積累，并具有濃度效應，EGCG濃度越高抑制作用越明顯。

圖1 不同濃度EGCG對前脂肪細胞分化影響Figure 1 Effects of different concentrations of EGCG on 3T3-L1 preadipocyte differentiation

2.2 不同濃度EGCG對PPARγ與FAS表達的影響

PPARγ與FAS（脂肪酸合成酶）能夠有效促進前脂肪細胞分化，因此試驗進一步探討了不同濃度EGCG分別對PPARγ、FAS的mRNA與蛋白表達的影響。如圖2所示，隨著EGCG濃度增加，PPARγ與FAS的表達量顯著下降。其中，在10 μM、50 μM與5 μM 組中，PPARγ和FAS的mRNA與蛋白表達差異均顯著（p<0.05）；而在 100 μM 組中，PPARγ和 FAS的mRNA與蛋白表達量極顯著下調（p< 0.01）。表明EGCG能直接抑制PPARγ和FAS的表達，從而影響前脂肪細胞分化。

圖2 不同濃度EGCG在脂肪生成過程中對PPARγ、FAS表達的影響Figure 2 Effects of different concentrations of EGCG on the expression of PPARγ, FAS during adipogenesis

2.3 EGCG對PI3K/AKT信號通路及FOXO1與P-FOXO1的影響

結果如圖3所示，磷酸化的P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1蛋白表達水平隨EGCG濃度的升高而降低，并且在100 μM組中達到最低，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性。然而，PI3K、AKT以及FOXO1蛋白表達量不受EGCG誘導的影響。磷酸化的P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1與正常PI3K、AKT以及FOXO1蛋白表達量比值也隨EGCG水平升高而降低。

圖3 不同濃度EGCG在脂肪生成過程中對PI3K/AKT信號通路及FOXO1、P-FOXO1表達的影響Figure 3 Effects of different concentrations of EGCG on PI3K/AKT signaling pathway and the expression of FOXO1, P-FOXO1 during adipogenesis

3 討論與結論

成熟脂肪細胞的一個重要特征就是積累脂質的能力。有研究表明，高糖和高脂肪飲食能夠誘導大鼠胰島素抵抗并引起肥胖[38]。通常，當攝入能量超過消耗時，多余能量以甘油三酯形式儲存在脂肪組織中。成熟的脂肪細胞體積顯著增大取決于甘油三酯數(shù)量，甘油三酯量越多，細胞越肥大[39]。因此，本試驗通過對不同濃度EGCG誘導的脂肪細胞進行油紅O染色并測定其甘油三酯的含量，結果表明，EGCG在脂肪生成過程中阻礙了脂滴的攝取和聚集。有報道表明，成年人輕度肥胖主要表現(xiàn)為肥大性肥胖，而兒童期肥胖或更嚴重的肥胖則為增生性肥胖[40]。盡管如此，肥大性和增生性肥胖都是前脂肪細胞的增殖分化，在適當?shù)沫h(huán)境和基因表達條件下，前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞[41-42]。因此，如果可以通過改變細胞的分化條件或操縱基因表達譜來抑制前脂肪細胞的分化，則有可能對肥胖進行預防和治療。本試驗結果表明，外源添加不同濃度EGCG可不同程度抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，因此我們推測EGCG具有抑制前脂肪細胞分化相關基因表達的功能。

大量研究表明，PPARγ能夠促進前脂肪細胞的分化和成熟，它與FAS在脂肪酸合成和脂肪生成過程中起決定性作用[43-45]。Kumar等[46]研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜提取物通過上調PI3K和PPARγ能夠提高由GLUT-4介導的糖攝取。Li[47]等人證實促進PPARγ表達能夠上調GLUT-4以及脂聯(lián)素表達，同時加快3T3-L1前脂肪細胞分化。本試驗結果顯示，外源添加特定濃度的EGCG導致PPARγ和FAS的mRNA及蛋白表達水平顯著下調，進一步證實了EGCG具有抑制3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的功能。

大量研究表明，PI3K-AKT級聯(lián)信號通路參與了早期脂肪的形成。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)PI3KAKT信號通路在預防肥胖和糖尿病方面發(fā)揮了關鍵作用，主要負責改善胰島素敏感性[35]。Harmon等發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/AKT信號通路可有效抑制前脂肪細胞葡萄糖攝取[49]。此外，Kim等發(fā)現(xiàn)柑橘類黃酮化合物可以通過抑制AKT信號通路從而阻礙3T3-L1前脂肪細胞分化[50]。因此，我們推測EGCG抑制3T3-L1前脂肪細胞分化可能通過PI3K/AKT級聯(lián)信號通路來發(fā)揮作用。FOXO1作為PI3K/AKT通路的下游信號在PI3K和PPARγ之間發(fā)揮其功能[48]；FOXO1能夠與PPARγ的啟動子結合，抑制PPARγ的核轉錄。當FOXO1上游的激酶AKT調控FOXO1發(fā)生磷酸化作用，磷酸化的FOXO1從細胞核轉移到細胞質，其抑制PPARγ和FAS表達的功能喪失[30]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG濃度增加，P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1蛋白表達量顯著下調，表明不同濃度的EGCG能夠不同程度的抑制FOXO1磷酸化，從而阻礙3T3-L1前脂肪細胞分化。

綜上，EGCG可通過介導PI3K/AKTFOXO1級聯(lián)信號通路下調PPARγ和FAS表達，從而抑制3T3-L1前脂肪細胞分化，阻礙脂肪生成。本研究結果可為EGCG及其類似預防和治療肥胖相關疾病提供理論依據(jù)。