激活蛋白-1 家族JunB、c-Jun、c-Maf、c-Fos在多發性骨髓瘤中的表達

燕法紅，邱志遠，李乾鵬，張曉婷，劉 洋，王寶宏

（濰坊醫學院第一附屬醫院/濰坊市人民醫院血液內科，山東 濰坊 261041）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆性漿細胞異常增殖的惡性疾病，在我國血液系統惡性腫瘤中居于第2 位[1]。MM 可引起貧血、骨痛、腎損害等一系列癥狀，多發生于老年人，嚴重威脅患者生命安全。近年來，隨著新的藥物不斷應用，患者的預后得到了明顯改善，但仍然是一種不可治愈的疾病，深入開發新的靶向藥物是MM 治療領域的重點。轉錄因子是細胞內致癌信號通路的交匯點，在多種實體和血液系統惡性腫瘤中存在失調。轉錄因子激活蛋白-1 家族（activator protein-1，AP-1）以二聚體形式結合TPA 反應元件和相關的DNA 元件如cAMP 反應元件，從而調節一系列生理過程，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。隨著對AP-1 在腫瘤病理生理作用的研究逐漸深入，其家族成員近年來成為被積極開發的藥物靶點[2]。AP-1 為一類含有堿性亮氨酸拉鏈的轉錄因子家族，由Jun 蛋白家族（c-Jun、JunB 和JunD）、Fos 蛋白家族（c-Fos、FosB、Fra1 和Fra2）、ATF 蛋白家族（ATF2、ATF3/LRF1、BATF、JDP1、JDP2）和Maf 蛋白家族（c-Maf、MafA、MafB、MafF/G/K 和Nrl）中的蛋白亞基形成同源或異源二聚體。AP-1 在漿細胞生物學及MM 的發病機制中發揮了重要調控作用[3]。但相較于其他實體腫瘤，目前研究尚少。本研究主要觀察最常見的AP-1家族成員JunB、c-Jun、c-Fos、c-Maf mRNA 在初診MM 患者骨髓中的表達情況，探討這些AP-1 家族成員在MM 發病機理中的意義，為MM 新藥研發提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取濰坊醫學院第一附屬醫院2019年11 月-2020 年12 月收治的初診MM 患者26 例作為MM 組，其中男15 例，女11 例，年齡39～82歲，中位年齡66 歲。MM 診斷及分期標準參照《中國多發性骨髓瘤診治指南（2020 年修訂）》[1]。另選取同期14 例骨髓無惡性細胞的患者為對照組，其中男7例，女7 例，年齡18～70 歲，中位年齡55 歲，包括干細胞供者、缺鐵性貧血、原發免疫性血小板減少癥、骨髓正常的淋巴瘤患者。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 購自中國艾科瑞生物科技有限公司、PrimeScript RT Master Mix 購自日本TaKaRa 公 司、TB GreenPremix Ex Taq 購自日本TaKaRa 公司、RT-PCR 引物由華大基因科技股份有限公司合成、LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓有核細胞提取與凍存 MM 組和對照組行常規骨髓穿刺，采集骨髓液2 ml，置于EDTA 抗凝管中，加入紅細胞裂解液，室溫靜置10 min，1500 r/min離心10 min，PBS 洗滌2 次，棄上清，細胞沉淀中加入Trizol，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2 RT-PCR 檢測JunB、c-Jun、c-Maf、c-Fos mRNA表達水平 按照反轉錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix 說明逆轉錄RNA 為cDNA，反應條件為37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃保存。然后進行PCR 反應，按照TB GreenPremix Ex Taq 試劑盒說明書進行，反應條件為變性95 ℃30 s，一個循環；PCR 95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環；融解95 ℃5 s，60 ℃1 min，95 ℃，1 個循環；降溫50 ℃30 s，1 個循環。JunB 基因上游引物序列為：5'-ACGACTCATACACAGCTACGG-3'，下游引物序列為5'-GCTCGGTTTCAGGAGTTTGTAGT-3'。c-Jun 基因上游引物序列為：5'-ACTCGGACCTCCTCACCTCG-3'，下游引物序列為5'-TGTTTAAGCTGTGCCACCTGTT-3'。c-Maf 基因上游引物序列為：5'-CAGCTCACGATTCCTGGGG-3'，下游引物序列為5'-CAGCGGCTTGGGTTACTCA-3'。c-Fos 基因上游引物序列為：5'-CAGTCAGATCAAGGGAAGCCACAGACATCT-3'，下游引物序列為5'-GAATAAGATGGCTGCAGCCAAATGCCGCA-3'。內參β-actin 上游引物序列為5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'，下游引物序列為5'-AGCACTGT GTGTTGGCGTACAG-3'。以2-ΔΔCt法表示mRNA 的相對表達量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。計量資料采用（）表示，比較采用獨立樣本的t檢驗，應用GraphPad Prism5 軟件作圖，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

MM 組JunB、c-Jun mRNA 的表達水平高于對照組，其中c-Jun 升高最多，超過對照組的3 倍。JunB 次之，較對照組升高約1.5 倍，差異均有統計學意義（P＜0.05）；兩組c-Maf mRNA、c-Fos mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1、圖1。

表1 兩組骨髓JunB、c-Jun、c-Maf、c-Fos mRNA 表達水平比較（）

表1 兩組骨髓JunB、c-Jun、c-Maf、c-Fos mRNA 表達水平比較（）

圖1 兩組骨髓JunB、c-Jun、c-Maf、c-Fos mRNA 表達水平比較

3 討論

近年來，多項研究發現AP-1 家族成員在MM的發病機制中發揮重要作用，針對AP-1 的靶向治療成為MM 治療的研究熱點。Fan F 等[4]觀察了AP-1家族的JunB、c-Jun、c-Fos、c-Maf 在MM 發病及耐藥機制中的作用，發現JunB 作用最為突出。MEK/MAPK 與NFκB 依賴性JunB 表達對MM 細胞的增殖與存活至關重要，JunB 還可誘導MM 細胞對激素與硼替佐米耐藥。此外，JunB 可提高VEGF、VEGFB、IGF1 等促血管生長因子的表達，促進MM血管新生，從而促進腫瘤生長[5，6]。JunB 也可通過影響成骨細胞與破骨細胞的數量與功能參與MM 骨病的發生[7]。本研究發現JunB 在初診MM 患者中表達上調，與既往研究結果一致，說明JunB 表達異常在MM 的發病機制中發揮重要作用。

c-Jun 作為原癌基因，在多種腫瘤中發現表達上調。如c-Jun N 端激酶（N-terminal Kinase，JNK）在霍奇金淋巴瘤細胞中呈高活性，有助于細胞循環周期不可控從而促進腫瘤細胞增殖[8]。然而，在關于MM 的研究中，多位學者發現c-Jun 起到抑制MM發展的作用。MM 患者比正常患者c-Jun/Fos 活性降低[9]。低水平c-Jun 的MM 患者比正常患者以及高水平c-JunMM 患者預后更好，藥物誘導c-Jun 表達可抑制MM 細胞增殖并誘導其凋亡[10]。Mcl-1128-350片段通過誘導c-Jun 易位至細胞核可觸發MM 細胞死亡[11]。JNK 誘導c-Jun 結合到p53 啟動子區域的AP-1 結合位點，上調p53，可誘發細胞凋亡[12]。本研究發現，c-Jun 在MM 患者中表達上調，與既往關于MM 的研究不一致，可進一步擴大病例深入研究，明確c-Jun 在MM 發病中的確切作用。

關于c-Maf 在MM 發病機制中的研究，目前認為它作為原癌基因，對MM 的發生起到推動作用。約有10%～15%的MM 患者存在t（14:16）染色體易位，該遺傳學異常可累及16q23 區域的c-Maf，使Maf 蛋白高表達。研究發現c-Maf 在MM 細胞中表達上調[13]。徐冬等[14]應用c-Maf siRNA 抑制c-maf 基因的表達后，可明顯抑制MM 細胞系RPMI8226 的增殖活性及侵襲力。c-Maf 可促進MM 細胞的增殖、遷移、侵襲以及與骨髓基質細胞的粘附，并誘導對硼替佐米耐藥，它還通過增加VEGF 的產生促進血管生成。c-Maf 在MM 細胞中的表達普遍上調，已被作為一個潛在的治療靶點[15]。本研究并未發現MM 患者c-Maf mRNA 表達水平與正常對照組有差異，考慮可能Fan F 等[4]的研究類似，其在MM 發病中的重要性不及JunB、c-Jun 等其他AP-1 家族成員。

關于c-Fos 與MM 的關系，目前研究認為其主要與MM 骨病的發生密切相關，而其他功能少見報道。c-Fos 是參與破骨細胞分化的重要轉錄因子，c-Fos 缺失可導致破骨細胞分化障礙。Fan F 等[4]的研究觀察到c-Fos mRNA 及蛋白在MM 細胞中表達微弱。在本研究中，亦未發現初診MM 患者骨髓有核細胞中c-Fos mRNA 表達異常，考慮除了影響骨病之外，c-Fos 在MM 的發病機制中作用不顯著。

綜上所述，AP-1 家族成員JunB、c-Jun 在初診MM 中表達上調，在MM 的發病機制中可能發揮重要作用，而c-Maf、c-Fos 未發現明顯異常，研發關于JunB、c-Jun 的靶向藥物可能為MM 的治療提供新策略。