紫花苜蓿氮效率及其類型特征研究

劉曉靜，趙雅姣，郝鳳，童長春

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅蘭州730070）

作物的氮效率表現為作物對氮素的響應，主要表現在作物對氮素吸收效率和利用效率上的差異，進而表現出不同的生長及營養狀況［1］。自1939 年Harvey［2］首次發現玉米（Zea mays）的不同品種在氮素吸收方面存在差異以來，有關植物品種間氮效率差異引起了研究者的廣泛關注，大量研究工作就此展開。目前，在對小麥（Triticum aestivum）［3］、水稻（Oryza sativa）［4］、玉米［5］和油菜（Brassica napus）［6］的研究中均證實同一種作物的不同品種在氮效率方面存在差異，主要表現為不同品種在不同氮素水平下對氮素的吸收和利用等方面的差異，同時，施用不同氮肥后其生長及生理特性也不盡相同。因此，在不同供氮水平下篩選具有產量增長潛力的氮高效品種以及發掘作物氮高效潛力，是提高氮肥利用效率，減少氮肥損失以及作物高效栽培的重要途徑。

目前，針對多種作物進行的氮高效種質的篩選普遍認為，氮高效種質的篩選應滿足以下條件：一是材料來源廣泛具有代表性且遺傳基礎豐富多樣；二是適宜的篩選條件，即評價指標、篩選壓力、篩選時期和評價方法等。關于氮效率評價指標的選擇主要集中在作物生長特性、根系、產量、氮素積累等方面，利用這些指標進行的氮效率篩選都獲得了較為理想的研究結果。作物氮高效種質通常表現為高的生物產量（營養體、果實和籽粒）、氮濃度、氮積累量、葉數等［7-8］。另有研究認為，包括根長和根體積在內的根系形態參數會影響作物地上部的生長和氮素吸收，進而影響氮效率的高低［9-10］。因此，生物量、根系參數和氮素積累是當前評價植物氮效率的常用參數。另外，在篩選時期的選擇上研究者普遍認為，生育前期為作物對養分吸收的敏感時期，與成熟期的氮營養相關指標的性狀存在顯著相關性［11］，并且苗期試驗周期短，適合對大規模材料進行氮效率初篩，苗期對作物進行氮效率的評價是簡單、快速、可靠的科學方法。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上栽培最早、分布最廣的多年生豆科牧草，與禾谷類作物相比可以大大提高粗蛋白質的產出，是解決我國畜牧業發展中蛋白飼料資源短缺的重要途徑和有效方法［12］。作為豆科牧草，紫花苜蓿的生物固氮過程可為其生長發育提供氮素營養，但并不能完全滿足其生長所需［13］。為此，實踐中為了達到優質高產的生產目的，必須確保高效生產的氮素所需，施用氮肥成為紫花苜蓿優質高效生產的必要保證。因此，氮肥使用量的逐年增加是促進紫花苜蓿高產的重要因素之一。然而，施氮也會帶來一系列的不良影響，并且由此引起的“氮阻遏”效應，不僅大大降低了生物固氮這個自然界最為主要的氮積累途徑的效率［14-15］，還會造成嚴重的環境問題［16］。而挖掘紫花苜蓿自身氮高效的遺傳潛力、開發氮高效利用是提高其營養效率的重要途徑之一，也是最快速、最易于推廣“減肥”農業生產目標的方法。目前，已在實踐中發現紫花苜蓿對氮肥的響應確實存在品種間差異，氮肥對生產性能的促進作用明顯不同，品種間肥料報酬率存在極顯著差異［17］。因此，開展紫花苜蓿氮效率研究，了解其品種間氮效率差異特征及規律，有助于制定優化牧草生產和減少養分損失的施肥管理策略，對優質高效生產具有重要的理論價值和實踐意義，也是進一步篩選氮高效種質、培育兼具高產與節肥新品種的必要基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用來源較為廣泛，同時代表性強、遺傳背景豐富的紫花苜蓿品種為試驗材料（表1）。根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）為“中華12531”，由甘肅農業大學提供。

表1 紫花苜蓿品種及編號Table 1 Alfalfa cultivars and their marked numbers

1.2 試驗設計

試驗于 2016 年在甘肅農業大學控溫室內進行（光照 28 ℃/14 h，黑暗20 ℃/10 h，光照強度 260～350 mol·m-2·s-1，相對濕度60%～70%）。試驗為28 個品種×2 個氮水平=56 個處理。試驗選用均一且飽滿的紫花苜蓿種子進行播種，播種前先進行消毒（70%酒精浸泡5 min，再用蒸餾水清洗3 遍），同時對播種的細砂用蒸餾水反復清洗，并用烘箱進行滅菌和烘干（120 ℃烘5 h 以上）；播種時，將消毒后的紫花苜蓿種子撒播至直徑9 cm、高12 cm 裝有滅菌砂的營養缽中，待出苗后，每盆保留10 株健壯幼苗。長至2 葉1 心時，進行不同氮水平的處理（500 mL·盆-1營養液），用蒸餾水每周進行沖洗，至沙子中積累的鹽分沖洗干凈后再重新澆入營養液。長至3 片復葉時，每盆接種根瘤菌液（25 mL·盆-1，OD600為0.63～0.64）。處理35 d（苗期，根瘤已形成）后將紫花苜蓿莖葉和根系分開取樣，進行形態和營養指標的測定。以Hoagland-Arnon 營養液為基本營養液，以NO3--N∶NH4+-N=1∶1（m∶m）為氮源，設低氮（2.1 mg·L-1）和適宜氮（210 mg·L-1，該氮素水平為本團隊篩選出的紫花苜蓿最適宜氮素濃度［18］）2 個水平，分別以 N2.1和 N210表示，調節營養液 pH 為 7，每個處理重復 6 次。

1.3 測定指標

紫花苜蓿氮效率高低主要是由其生物量和氮素積累量高低決定的。株高的大小一般可以反映植株生長的快慢，根長和根體積一般可以反映植株對營養物質吸收的好壞。因此，本研究選用地上/地下干物質重、全株干物質重、株高、根長、根體積、地上/地下氮含量、全株氮含量、地上/地下氮積累量、全株氮積累量等指標對不同紫花苜蓿種質進行氮效率評價指標的篩選以及氮效率的劃分。

采用直尺測定垂直高度（莖基部到生長點的距離）；通過EPSON Expression 掃描儀（10000XL，杭州）和WinRHIZO 分析系統測定根系總長度和根體積；采用烘干法測定干物質重；采用半微量凱氏定氮法測定氮含量；氮素積累量=干物質量×氮含量［19］。

1.4 數據分析

采用隸屬函數法將紫花苜蓿氮效率評價指標進行綜合評價［20］。采用Excel 2007 進行數據整理和圖表繪制，采用SPSS 17.0 進行顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿苗期性狀的分析

2.1.1 不同氮水平對株高、干物質重的影響 LW6010 在N2.1和N210水平下（表2），其株高、地上干物質重、地下干物質重和全株干物質重均顯著高于其他品種（P＜0.05）。游客在N2.1下，其株高顯著小于其他品種；精英和威斯頓在N210下，其株高顯著小于其他品種（P＜0.05）。公農3 號在N2.1和N210下均表現為地上干物質重顯著小于其他品種（P＜0.05）。公農3 號在N2.1和甘農4 號在N210下，其地下干物質重顯著小于其他品種（P＜0.05）。賽迪7 在N2.1下，其全株干物質重顯著低于其他品種（P＜0.05）。

表2 不同紫花苜蓿品種株高和生物量在不同氮素水平下的差異Table 2 Differences of plant height and biomass of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

2.1.2 不同氮水平對根長、根體積的影響 不同品種紫花苜蓿的根長和根體積在不同氮素水平下均表現不同（表3）。N2.1下，甘農9 號的根長最長，其次為皇冠，隴東苜蓿最短；N210下，皇冠最長，公農3 號最短。N2.1下，新疆大葉根體積最大，隴東苜蓿最小；N210下，甘農7 號最大，甘農4 號、甘農5 號、公農3 號和賽迪10 較小。

表3 不同紫花苜蓿品種根長和根體積在不同氮素水平下的差異Table 3 Differences of root length and root volume of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

2.1.3 不同氮水平對氮含量的影響 巨能601 在N2.1和N210下（表4），其地上氮含量和全株氮含量均顯著大于其他品種（除LW6010）（P＜0.05）。N2.1下，甘農9 號地下氮含量顯著大于其他品種；N210下，公農1 號顯著大于其他品種（P＜0.05）。

表4 不同紫花苜蓿品種氮含量在不同氮素水平下的差異Table 4 Differences of nitrogen content of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels（%）

2.1.4 不同氮水平對氮積累量的影響 LW6010 在N2.1和N210下（表5），其地上氮積累量、地下氮積累量和全株氮積累量均顯著大于其他品種（P＜0.05）。N2.1下，甘農3 號的地上氮積累量顯著小于其他品種；N210下，賽迪7和游客地上氮積累量顯著小于其他品種（P＜0.05）。N2.1下，隴東苜蓿、公農1 號、賽迪7 和精英地下氮積累量均顯著小于其他品種（P＜0.05）。N2.1下公農3 號和N210下賽迪7 和游客的全株氮積累量均小于其他品種（P＜0.05）。

表5 不同紫花苜蓿品種氮積累在不同氮素水平下的差異Table 5 Differences of nitrogen accumulation of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels（mg·plant-1）

2.2 紫花苜蓿各性狀的變異分析

28 個紫花苜蓿品種在N2.1和N210下各指標的變異幅度相差較大（表6）。N2.1下，各指標變異系數范圍為10.8%～29.1%，其中地上部氮積累量最大，為29.1%；單株氮含量最小，為10.8%。N210下，各指標變異系數范圍為9.4%～29.4%，其中地上部氮積累量變異系數最大，為29.4%；地下部氮含量最小，為9.4%。同時，在N2.1和N210下，地上部氮積累量、單株氮積累量、地下部氮積累量、地下部干重、根體積、地上部干重、單株干重和根長8個指標的變異系數較大（CV≥20%）；而株高、地下部氮含量、單株氮含量、地上部氮含量4 個指標的變異系數較小（CV＜20%）。此外，地上部干重、地下部干重、株高、地下部氮含量、地下部氮積累量在N2.1下的變異系數均大于N210，其余指標相反。

表6 紫花苜蓿苗期各性狀在不同氮水平下的變化幅度Table 6 Traits variations of alfalfa cultivars at the seedling stage under different nitrogen levels

2.3 相關性分析

N2.1下，地上部干重、單株干重、根長、根體積、地上部氮積累量、地下部氮積累量、單株氮積累量之間呈極顯著正相關，相關系數0.522～0.950（表7）。N210下，地上部干重、單株干重、株高、根長、根體積、地上部氮積累量、單株氮積累量之間呈極顯著正相關，相關系數0.538～0.996。在低氮和正常氮條件下，地上部干重、單株干重、根長、根體積、地上部氮積累量和單株氮積累量之間均呈極顯著正相關關系。

表7 不同氮水平下紫花苜蓿苗期各指標的相關性分析Table 7 Correlation of different alfalfa parameters at seedling stage under different nitrogen levels

2.4 評價指標隸屬函數綜合值分析

通過客觀賦權得到評價指標的權重值（表8）。通過隸屬函數法和復合運算得到不同紫花苜蓿品種的氮效率綜合指數（表9）。N2.1下，最大相差66 倍，LW6010、巨能601、甘農5 號綜合指數大于80%。N210下，最大相差14倍，LW6010、巨能601、甘農5 號、龍牧806 大于80%。在N2.1和N210下，均在40%以下的6 個品種分別是隴東苜蓿、威斯頓、巨能6、公農1 號、游客和賽迪7。

表8 不同氮水平下紫花苜蓿各評價指標的權重Table 8 Weights of evaluation indices of different alfalfa cultivars under different nitrogen levels

表9 不同氮水平下紫花苜蓿氮效率隸屬函數綜合指數Table 9 Integrated values of nitrogen use efficiency under different nitrogen levels

2.5 氮效率類型劃分

通過不同品種在N2.1和N210下的綜合指數（圖1），可將紫花苜蓿品種分為4 類：高效型，LW6010、甘農5 號、龍牧 806、巨能 2、巨能 601 在 N2.1和 N210下綜合值均大于 0.5；常效型，甘農 3 號、甘農 4 號、新疆大葉、新牧 1 號在 N2.1下綜合值小于 0.5，在 N210下大于 0.5；反效型，甘農 7 號、甘農 9 號、龍牧 801、公農 3 號、精英、賽迪 10、巨能 551 在N2.1下綜合值大于0.5，在N210下小于0.5；低效型，隴東苜蓿、甘農8 號、公農1 號、馴鹿、金黃后、威斯頓、游客、巨能6、阿爾岡金、賽迪7 在N2.1和N210下綜合值均小于0.5。

圖1 紫花苜蓿氮效率類型劃分Fig.1 Classification of nitrogen efficiency of alfalfa

3 討論

在本研究中，不同紫花苜蓿品種苗期生物量、根系參數和氮素積累量等氮營養相關指標存在顯著差異性，這與小麥［21-22］、水稻［23-24］、玉米［25-26］、大豆（Glycine max）［27-28］等的研究結果一致，表明供試紫花苜蓿基因型的氮素營養性狀具有較大的遺傳變異，即品種間存在氮效率差異，此結果也很好地印證了本團隊的前期研究發現［17］。

通過變異系數和相關性，本研究得出地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量可作為苗期氮效率篩選的評價參數。在低氮和適宜氮水平下，紫花苜蓿地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量等指標的變異系數較大，同時相互之間的相關性較高，表明該指標可以有效區分不同紫花苜蓿品種間的差異，適于篩選氮效率類型。同樣，在現有的評價體系中，氮效率的評價參數也主要集中在生長特性、根系、產量和氮素積累等方面。例如，劉敏娜等［29］選擇地上部干物質量作為菠菜（Spinacia oleracea）苗期氮效率的主要評價指標，地上部氮積累量、氮素吸收效率和氮素利用效率為輔助指標。李梁等［11］認為相對分蘗數、相對莖葉干重和相對整株干重可作為大麥（Hordeum vulgare）苗期氮高效評價指標。匡藝等［30］認為氮素利用率是主要指標，株高、地上部生物量可作為小黑麥氮高效評價輔助指標。同時，氮高效紫花苜蓿品種的地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量無論在低氮還是高氮水平下均顯著高于氮低效品種，這也進一步說明該指標具有明顯的代表性，可作為氮效率評價的指標。氮高效甘藍型油菜在根和莖生物量、根形態、氮積累、氮肥吸收效率等方面也表現出比氮低效品種更高的值［31］。根長和根體積代表了作物對氮素的吸收能力，而作物在生長前期對氮素的吸收能力又對其生長發育起關鍵作用［32］。本研究中，根長和根體積與干物質重和N 積累呈極顯著正相關，這是因為根系發達，吸氮效率更高，生物量增加，植物氮積累量更大［33］。魏海燕等［34］對水稻的研究也指出根系的吸收能力是獲得更高地上生物量的基礎。因此，地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量作為苗期篩選的評價參數是合理的。

對28 個不同來源紫花苜蓿品種的氮效率關鍵指標通過隸屬函數法進行綜合評價和分析，這與使用類似氮效率參數評估作物氮效率的單一或平均表現的研究不同，由于作物氮素效率非常復雜，進行更全面地分析評價，可以得到更準確的結果。目前，使用該方法進行氮效率篩選也被越來越多的研究者們認可［35-36］。研究中發現，紫花苜蓿氮效率表現為以下特征：LW6010 和甘農5 號等品種無論環境氮充足還是缺乏均表現為氮營養高效；甘農3號、甘農4 號等品種在環境氮水平充足時表現為氮營養高效，缺乏時表現為氮營養低效；甘農7 號、龍牧801 等品種在環境氮充足時表現為氮營養低效，缺乏時卻表現為氮營養高效；隴東苜蓿等品種無論環境氮充足還是缺乏均表現為氮營養低效，不同品種表現出了明顯不同的氮效率差異規律，因此，根據本研究中紫花苜蓿所表現出氮效率特征的不同，將其按氮效率特征劃分為4 個類型，并分別命名為：氮高效型、氮常效型、氮反效型和氮低效型。不同作物的氮效率類型有不同的分類。例如，Tsai 等［37］將玉米分為3 種氮效率類型，敏感型、中間型和非敏感型，在這一分類中，敏感型可以代表作物對環境氮的響應能力，而不能代表作物的氮效率。Kumar 等［38］對玉米氮效率的分類為高效與響應型、非高效與響應型、非高效與非響應型、高效與非響應型。He 等［6］將油菜品種分為4 種氮效率類型：氮響應型、氮無響應型、氮高效型和氮低效型。這些類型的劃分標準均是以不同作物品種對氮素的不同響應。Chen 等［35］，劉敏娜等［29］和趙春波等［39］分別將玉米、菠菜和黃瓜（Cucumis sativus）分為 4 類：高效型、高氮高效型、低氮高效型、低效型，明確指出了環境氮素與作物的關系。在本研究中，氮效率類型直接反映了苜蓿的氮效率，類型劃分及命名更為直觀。同時，本研究將紫花苜蓿氮效率進行了量化，即通過地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量6 個指標在低氮和適宜氮下進行綜合分析，并通過其綜合值進行劃分，即低氮和適宜氮下其綜合值均大于0.5 為氮高效型；低氮下小于0.5，適宜氮下大于0.5 為氮常效型；低氮下大于0.5，適宜氮下小于0.5 為氮反效型；低氮和適宜氮下均小于0.5 為氮低效型。相對前人研究而言（以不同品種間對氮素響應的差異和比較來劃分氮效率類型），本研究通過量化指標進而對氮效率進行劃分更為直觀、便捷，也具有較高的可重復性，同時對單個紫花苜蓿品種也可以通過此方法進行快速氮效率類型的認定。

不同氮效率類型的紫花苜蓿具有不同的生理特點，其在生產中的管理和應用也不同。可以根據紫花苜蓿的氮效率類型特征有針對性地施用氮肥，以達到高產優質的目的，提高氮肥利用率，減少浪費［40］。在本研究中，氮高效型紫花苜蓿品種具有較強的適應性和較高的利用價值。因此，LW6010 和甘農5 號等品種比其他品種可少施氮肥，同時表現出較好的產量和品質。Chen 等［35］發現高效型玉米品種的平均產量高于所有受試品種，在低氮、常氮和高氮條件下，高效型品種的產量分別比所有供試品種的平均產量高15.00%、6.62%和7.57%，潛在的氮肥節約量為25.2%～15.9%。Worku 等［41］報道表明，高效型玉米品種有可能增產10.7%，減少氮肥投入12.7%。因此，氮高效型紫花苜蓿可適用于所有農業系統，并且降低氮肥施用。對于常效型紫花苜蓿品種，本研究建議可通過適當施氮來提高產量，如甘農3 號和甘農4 號等。本團隊前期研究發現，施氮后，甘農3 號的株高、產量和品質均顯著高于隴東苜蓿［18］，說明常效型品種具有較高的肥料利用率。Chen 等［35］研究表明，如果在華北和東北地區使用高效型和/或常效型玉米品種，產量可提高10%～15%，氮肥投入可減少10%～20%。氮反效型紫花苜蓿品種甘農7 號和甘農9 號對土壤低氮的耐受性強于其他類型，因此，它們可以在氮肥用量較少的土地上生長。對于氮低效型紫花苜蓿品種，雖然其氮效率低，對外源氮素不敏感，但其卻具有其他方面的優勢，例如隴東苜蓿因其具有較強的抗逆性，使其成為優良的地方品種。總的來說，氮效率的分類不僅可以發掘高效氮種質資源，而且可以指導紫花苜蓿生產中氮營養管理的針對性施肥。

4 結論

通過對不同紫花苜蓿品種苗期性狀的變異分析和隸屬函數綜合值分析，得出地上干物質重、全株干物質重、根長、根體積、地上氮積累量和全株氮積累量可作為氮效率的篩選指標。

根據氮效率篩選指標的差異，并量化其綜合值，在這個標準下可將紫花苜蓿分為4 個類型：氮高效型、氮常效型、氮反效型和氮低效型。