祁連山不同類型草地土壤細菌群落特征研究

趙文 ，尹亞麗 ，李世雄 ，2*，劉燕 ，劉晶晶 ，董怡玲 ，蘇世鋒 ，吉凌鶴

（1. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海西寧810016；2. 青海大學三江源區高寒草地生態教育部重點實驗室，青海西寧810016；3. 甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070）

祁連山位于青藏、蒙新、黃土三大高原交匯的生態脆弱地帶，在維持動植物物種多樣性和涵養內陸河水源方面發揮著不可替代的作用，被稱為架構在西北地區生態安全屏障的“生態之脊”［1］。草地生態系統是祁連山主要的生態系統，在溫度和水分因子的驅動下，祁連山地區從低海拔到高海拔分布著10 種不同類型的草地，呈現出明顯的分異和組合［2-3］。不同類型草地的存在不僅對當地畜牧業發展起著至關重要的作用，亦在維持我國草地生態系統的穩定性和多樣性等方面占有不可或缺的分量［4］。然而近幾十年，尤其是從20 世紀90 年代實行的草場承包到戶，導致了大面積的過度放牧，造成了草地退化、水土流失、嚙齒動物大量繁殖以及一系列生態系統失衡問題［5-6］。其中高寒草甸生態系統氣候寒冷，屬多年凍土，是生物多樣性變化的敏感區域［7］；沼澤化草甸是介于草甸與沼澤之間的過渡類型，是易受環境干擾的生態脆弱區［8］。在過度放牧等因素的影響下，部分高寒草甸出現大面積裸斑塊，優勢物種減少，形成以毒雜草為主的黑土灘退化草地，失去了原有的生態功能和經濟價值［9］。建植人工草地是快速恢復黑土灘最有效的辦法，植被恢復的同時對土壤微生物區系產生影響［10］。土壤微生物與生態系統功能密不可分，在維持地上植被多樣性和土壤養分平衡中發揮著重要作用，同時土壤微生物是動態變化的自組織系統，通過遺傳維持其組成和結構的相對穩定，通過變異適應環境干擾［11-12］。因此，從微生物的數量組成和物種豐度了解土壤微生物系統［13］，對了解草地微生物群落結構具有重要的意義。

微生物是土壤生態系統的重要組成部分，參與碳、氮循環，有機化合物分解及能量傳輸、運送等多種過程，對維持生態系統穩定和可持續性方面有重要的作用［14］。細菌可以提供本地化參照系中特定的生態系統指標，用以評估土地價值［15］。因此，探究細菌群落的多樣性及群落結構，對評價和調控草地生態功能具有參考價值。已有研究表明，環境因素驅動了土壤微生物群落在全球尺度上的分布，呈現出不同生物地理模式［16］，劉怡萱等［17］綜合比較青藏高原區域大尺度，發現東部、中部和東北部地區細菌群落的豐富度和多樣性較高，西部以及西北部地區較低；Wang 等［18］對新疆和內蒙古橫跨3700 km 的多種草地類型長期研究發現，大區域尺度下微生物共存網絡主要受年均降水量影響。也有研究指出土壤細菌隨生態類型變化也出現相應改變，青藏高原由東向西從農用地到高寒草甸，細菌群落出現顯著的差異［19］。但是區域大尺度下影響微生物群落的因素眾多，且各因素間綜合作用對于微生物影響也未可知，而小區域生境內環境因子的影響會顯著降低，這將有助于了解土壤細菌群落的組成［20］。因此，本研究以祁連山區高寒草甸、沼澤化草甸和人工草地為對象，采用高通量測序技術，對3 種類型草地土壤細菌群落特征進行分析，闡明土壤細菌物種組成及群落結構等在草地類型間的異同點，揭示土壤環境因子與細菌群落間的網絡調控關系，為祁連山草地生態環境保護及利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究地位于青海省祁連縣默勒鎮瓦日尕村（37°56′48.60″N，100°13′13.80″E，海拔約3650 m），屬高原大陸性氣候，冷季長、暖季短，年均溫-1.7 ℃，1 月平均氣溫-14.8 ℃，7 月平均氣溫9.8 ℃，氣溫日較差大，干濕分明，氣溫和降水垂直變化明顯，雨熱同期，年平均降水量為614.8 mm。該區光能資源豐富，日照時間長，輻射強，年蒸發量1162.3 mm［21］。草地植被主要以高寒草甸為主，其優勢種主要有矮嵩草（Kobresia humilis）、垂穗披堿草（Elymus nutans）、草地早熟禾（Poa pratensis）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）等，植被蓋度和物種豐富度見表 1。人工草地主要以草地早熟禾、芒洽草（Koeleria litvinowii）、中華羊茅（Festuca sinensis）、冷地早熟禾（Poa crymophila）等為主。沼澤化草甸是苔草型沼澤化草甸，優勢物種有青藏苔草（Carex moorcroftii）、線葉嵩草（Kobresia capillifolia）、矮嵩草等。

表1 不同草地類型植被蓋度及物種豐富度Table 1 Vegetation coverage and species richness in different grassland types

1.2 樣地設置與測定方法

在青海省祁連縣默勒鎮選擇3 塊面積分別約為50 hm2的高寒草甸、沼澤化草甸及人工草地為試驗樣地，樣地間隔約5 km，各處理樣地設4 個試驗小區為重復，共12 個小區，每個小區面積約1200 m2。高寒草甸和沼澤化草甸均是原生草甸，分別為春季牧場（4-12 月放牧）和夏季牧場（7-9 月放牧）。人工草地是高寒草甸退化為黑土灘，經過深翻、耙平、施肥（一次性施 N 肥 61.5 kg·hm-2、P 肥 68.9 kg·hm-2）、撒種（播量 15 kg·hm-2）、覆土、鎮壓等農藝措施建植的混播人工草地，建植周期為4 年，返青期（4-6 月）完全禁牧，冬季放牧利用（每年11 月-次年4月），各草地放牧強度相同。

1.3 樣品采集及測定方法

2018 年8 月中旬在每小區隨機選取4 個面積為50 cm×50 cm 的樣方，對植被群落特征進行調查。用直徑3.5 cm 的土鉆，每小區隨機取5～8 點，采集0～10 cm 土樣，每個小區混合為一個土樣，并過2 mm 的篩，充分混勻后分成兩份，1 份室內陰干用于土壤理化性質分析。采用酸度計電位法常溫下（土水比1∶5）測定土壤pH；采用烘干稱重法測定土壤含水量（soil water content，SWC）；參照楊劍虹等［22］的測定方法，采用硫酸銅-硫酸鉀（10∶1）-濃硫酸消解，凱氏定氮法測定土壤全氮（total nitrogen，TN）含量，采用氯化鉀浸提法測定硝態氮（nitrate nitrogen，NN）和氨態氮（ammonia nitrogen，AN）含量；采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定全磷（total phosphorus，TP）含量；采用H2SO4-K2Cr2O7外加熱，硫酸亞鐵滴定測定土壤有機質碳（total organic carbon，TOC）含量。

另一份土壤樣品裝于自封袋，夾棉塞透氣，用冰盒帶回實驗室，裝入10 mL 離心管，干冰運輸至廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序，測序和生物信息服務在Illumina 250 PE 平臺完成。土壤DNA 用HiPure Soil DNA kits 試劑盒按照步驟提取，獲得DNA 總樣在Nanorop 微量分光光度計（Nanorop 2000，美國）上進行質量檢測。同時對核酸樣本進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其目的是檢驗核酸樣本的完整性，是否發生降解，是否有蛋白等污染。PCR 擴增是 用 帶 有 barcode 的 特 異 引 物 擴 增 16S rDNA 的 V3～V4區 ，引 物 序 列 為 341F（CCTACGGGN GGCWGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）［23］。PCR 反應體系［24］：5 μL KOD 緩沖液（10×），1 μL KOD 高保真 DNA 聚合酶，5 μL（2 mmol·L-1）dNTPs，正向和反向引物各 1.5 μL（10 μmol·L-1），加入適當的模板，使用一定量的ddH2O 將反應體系總體積擴充至50 μL 。擴增程序：94 ℃預變性2 min 后進行30 個循環，每個循環包括98 ℃變性10 s，62～66 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，循環結束后68 ℃延伸5 min。PCR 擴增產物用核酸純化試劑盒（AMPure XP Beads）進行產物純化，純化后使用Qubit（Qubit 3.0，美國）進行定量。使用AMPure XP Beads 對第 2 輪擴增產物進行純化，用 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies，美國）進行定量，由廣州基迪奧生物科技有限公司Illumina 250 PE 平臺完成測序。

1.4 生物信息學分析

測序得到原始序列（raw reads）之后，對低質量序列（reads）進行過濾，然后進行組裝和再過濾，用Uparse 軟件對所有樣品的全部有效序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units）結果。Uparse 在構建OTUs 的過程中會選取代表性序列（OTUs 中豐度最高的那條Tag 序列），將這些代表性序列集合用 RDP 分類器的 NBA 算法，與 Silva（Quast，2013）數據庫進行物種注釋［24］（設定置信度的閾值為 0.8～1.0）。

Simpson 指數（DS）是樣本中物種的豐富度與均勻度的綜合指標；Shannon 指數（H）是物種豐富度、均勻度的體現，是對群落結構的綜合反映；Chao1 指數是用于估算樣本物種總量的計算值。

式中：S 表示物種種類總數；Pi表示樣品中屬于第i種的個體比例，如樣品總個體為N，第i種個體數為ni，則Pi=ni/N；Sobs為觀察到的物種數，也就是測序分析得到的物種數；F1是樣本中數量為1 的物種數；F2是樣本中數量為2 的物種數。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0 對植被、土壤理化性質、微生物多樣性指數等數據進行單因素方差比較，結果均為平均值±標準誤。用Anosim（analysis of similarity）非參數檢驗法檢驗組間差異，用矩陣相關性分析土壤理化性質與土壤細菌群落之間的關系，所有數據均采用Excel 2006 整理。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

3 種類型草地0～10 cm 土壤理化性質均表現出不同程度的差異（表2），其中沼澤化草甸土壤全氮、全磷、有機質碳含量、含水量和硝態氮含量均顯著高于高寒草甸和人工草地（P＜0.05）；人工草地與高寒草甸間除含水量和硝態氮含量表現顯著差異外，其他指標均未表現顯著差異。

表2 土壤基本理化性質Table 2 Basic soil physical and chemical properties in the three investigated grassland（n=4）

2.2 不同草地類型土壤細菌群落OTU 組成及結構

在祁連山高寒草甸、人工草地和沼澤化草甸土壤中共得到有效序列1022446 條，平均每個樣本的有效序列為85203 條。以97%的一致性將有效序列聚類為OTU，3 種草地共檢測到60905 條，其中高寒草甸、人工草地、沼澤化草甸的 OTU 均值分別是 4917、5233、5075 條。

稀釋曲線分析顯示，當抽取的序列數達到25000時，曲線趨向于平緩，說明測序的數據量基本合理，更多的數據量對于發現新的OTU 貢獻不大（圖1）。韋恩分析顯示（圖2），在OTU 水平上，高寒草甸的特異性細菌 OTU 數（744）占總 OTU 的 12.95%；人工草地中細菌OTU 數（1016）占17.68%；沼澤化草甸細菌OTU 數（1245）占21.67%。此外，高寒草甸和人工草地共有細菌OTU 數（2211）占38.48%；人工草地和沼澤化草甸共有特異OTU 數（1636）占28.47%；高寒草甸和沼澤化草甸共有細菌OTU 數（1751）占30.47%，3 個草地共有細菌 OTU 數（1429）占24.87%。

圖1 不同類型草地土壤細菌稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of microbial communities in different grassland types

圖2 不同類型草地土壤細菌OTU 韋恩分析Fig. 2 Venn diagram of bacterial communities in different grassland types based on OTUs abundance

2.3 不同類型草地土壤細菌群落多樣性分析

對3 種草地土壤細菌多樣性指數進行分析，評估不同群落的均勻度和豐富度（表3）。Shannon 多樣性指數在人工草地最高，高寒草甸次之，沼澤化草甸最低，但差異不顯著；Simpson 指數在不同草地類型中差異不顯著，具體表現為高寒草甸＞沼澤化草甸＞人工草地；Chao1 指數表現為人工草地顯著高于其他兩類草地（P＜0.05），且高寒草甸顯著高于沼澤化草甸（P＜0.05）。

表3 不同草地類型土壤細菌群落豐富度和多樣性指數Table 3 Richness and diversity indices of bacteria communities in different grassland types

2.4 不同草地類型土壤細菌群落PCoA 分析與Anosim 分析

基于Unweight unifrac 距離對3 種草地土壤細菌群落進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），主坐標 1（PCo1）與主坐標 2（PCo2）對 3 種類型草地土壤細菌群落差異的解釋率分別為21.70%、12.18%，累計貢獻為33.88%。進一步的Anosim 分析結果表明3 種草地土壤細菌群落差異顯著（r=1.000，P=0.001，圖 3）。

圖3 不同類型草地土壤細菌群落PCoA 分析Fig. 3 PCoA analysis of bacterial communities from different grassland types

2.5 不同類型草地土壤細菌群落組成及結構變化

從3 種不同類型草地土壤中共檢測到相對豐度均大于1%的細菌分屬于10 個門（圖4），其分別占高寒草甸、人工草地和沼澤化草甸土壤細菌總數的94.61%、95.51% 和94.96%。3 種類型草地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為主要類群。其中沼澤化草甸土壤細菌群落的變形菌門類群顯著高于高寒草甸和人工草地（P＜0.05）；而沼澤化草甸的酸桿菌門和放線菌門豐度最低，顯著低于其他兩類草地；浮霉菌門在各草地間差異不顯著。

圖4 不同類型草地土壤細菌群落門水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria soil sample of different grassland types at the phylum level

在3 種類型草地土壤細菌屬水平上共得到369 個細菌屬水平類群，其中相對豐度大于1%的類群有18 個（圖5，表4）。高寒草甸相對豐度大于1%的細菌類群有5 個，主要以RB41（6.57%）、鞘氨醇單胞菌屬（3.43%）、慢生根瘤菌屬（2.63%）等為主要類群；人工草地相對豐度大于1%的類群有7 個，主要以鞘氨醇單胞菌屬（7.91%）、RB41（5.96%）、芽單胞菌屬（1.53%）等為主要類群；沼澤化草甸相對豐度大于1%的類群有6 個，主要以RB41（3.90%）、硝化螺旋菌屬（2.09%）、鞘氨醇單胞菌屬（1.68%）等為主要類群。對不同類型草地土壤細菌屬水平差異分析發現RB41、CL500-29_marine_group、中慢生根瘤菌屬、土微菌屬、類芽孢桿菌屬和慢生根瘤菌屬在高寒草甸顯著富集（P＜0.05）；鞘氨醇單胞菌屬、Subgroup_10、芽單胞菌屬、MND1、出芽菌屬、Ellin6067 在人工草地顯著富集（P＜0.05）；硝化螺旋菌屬、Massilia、Haliangium、假單胞菌屬在沼澤化草甸顯著富集（P＜0.05，圖5）。

圖5 不同類型草地土壤細菌屬水平群落結構分析Fig.5 Analysis of soil bacterial community structure in different types of grassland at the genus level

表4 不同草地土壤細菌屬水平群落信息Table 4 Information regarding the bacterial community at the genus level in different grassland types

2.6 土壤環境因子與細菌群落的相關性分析

采用Mantel tests 分析土壤理化性質與細菌群落的相關性，土壤細菌群落結構與有機質碳、全磷、土壤含水量、硝態氮、全氮顯著相關（P＜0.05，表5）。

表5 土壤理化性質與細菌群落結構的相關性Table 5 Correlation between bacterial communities and soil properties

用顯著相關的6 個土壤理化因子與細菌群落結構進行典范對應分析（CCA）。CCA 二維排序圖可以直觀地給出研究對象與環境變量之間的關系，排序軸與箭頭連線夾角表示環境因子與排序軸的相關性，夾角越小表明關系越密切，而箭頭連線表示環境因子與研究對象相關程度的大小，連線越短，相關性越小，反之越大。土壤有機質碳、全磷和含水量對細菌群落結構影響最大（P=0.001，圖 6，表 6），pH 對細菌群落無顯著影響。同時，沼澤化草甸與其他兩類草地有明顯的分異，土壤細菌主要聚類于土壤有機質碳、全磷、含水量高的區域，且沼澤化草甸土壤細菌群落受環境因子的影響大于其他兩類草地。

表6 土壤理化性質與門水平優勢細菌相關性Table 6 Correlation between properties and soil dominant bacteria at the phylum level

圖6 土壤細菌群落與環境因子間的典范對應分析Fig.6 Canonical correspondence analysis of bacterial communities with basic soil physical and environmental factors

3 討論

草地植被-土壤-微生物的作用與反饋是貫穿草地生態系統的重要紐帶，植物通過凋落和分泌為土壤微生物提供營養，促使植物和微生物之間協同進化［25］，土壤微生物通過選擇植被間接反映生態系統在演替過程中土壤和植被群落的演替方向。本研究通過高通量測序技術對祁連山3 種草地類型土壤細菌群落變化進行探究，結果表明不同草地土壤細菌群落差異顯著，多樣性分析顯示人工草地Chao1 指數顯著高于高寒草甸和沼澤化草甸（P＜0.05）。這可能是微生物對草地植被變化的響應，本研究中人工草地為建植4 年的草地，正處于人工草地暫穩態的演替階段［26］，植被的穩態可能重新塑造了適應于人工草地的微生物群落區系，Zhu 等［27］的研究表明，人工草地通過良好的根系網絡發育和凋落物積累改善了土壤生境，導致微生物群落發生變化。伍文憲等［28］在川西北以天然草地和兩種人工草地為研究對象，結果表明人工草地與天然草地的細菌Chao1、Shannon 指數無顯著性差異，本研究的結論與之相反，可能是由于人工草地地上植被不同及區域獨特性造成。本研究中高寒草甸的Chao1 指數顯著高于沼澤化草甸，這可能與沼澤化草甸的性質有關，沼澤化草甸處于向草甸過渡末期，加之人為因素的影響，原來積累的養分流失，微生物數量也會相應地減少［29］，另一方面植被的類型及其多樣性也可能影響微生物的多樣性，高寒草甸和沼澤化草甸植被物種組成有差異，造成對土壤表面的覆蓋程度不相同，同時土壤溫度、濕度的差異，加之不同植被群落結構植物的生長發育、枯枝落葉物多少有別，從而影響了土壤微生物數量和活動狀況。

進一步分析不同草地類型土壤細菌群落組成，發現本研究中3 種草地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為優勢類群，與絕大多數土壤優勢細菌門基本相同［30］。王穎等［31］以固原半干旱典型草原為研究對象，發現放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門是土壤細菌的主要類群；Zhang 等［32］在青藏高原北麓河流域以草甸、草原為研究對象，發現土壤細菌群落結構主要由變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門組成；Li 等［33］對西藏高寒草甸土壤細菌的研究指出無論高寒草地退化程度如何，變形菌門，放線菌門和酸桿菌門都是主要細菌類群，本研究結果與其基本一致。表明區域大尺度上土壤細菌群落的組成和分布有差異，但細菌優勢類群沒有顯著的差異。Chu 等［34］也探討了區域尺度和環境因子對微生物的影響，發現環境因子是區域微生物分布的主要驅動力。而本研究中植被的差異是最有可能造成微生物差異的環境原因，植被類型不同影響土壤理化性質，而土壤微生物受理化性質的影響出現地域性特點［35-36］。本研究中發現變形菌門是各草地豐度最大類群，這與Bazylinski 等［37］的研究一致，證實了變形菌門是陸地土壤生態系統細菌群落的優勢類群。差異性分析顯示沼澤化草甸土壤細菌群落的變形菌門豐度顯著高于高寒草甸和人工草地，進一步的相關性分析表明變形菌門與有機質碳、全磷和含水量極顯著正相關（表6），這可能是沼澤化草甸生態脆弱的原因，超過1/3 的OTU 來源于變形菌門，群落組成的單一化可能導致其聯系較為緊密，對外界的抵抗能力反而較弱［38］。而酸桿菌門和放線菌門在沼澤化草甸最低，并與土壤有機質碳、土壤含水量和氨態氮呈顯著負相關（P＜0.05），說明放線菌門和酸桿菌門易在偏貧瘠的地方富集。

祁連山3 種類型草地土壤細菌群落結構與土壤有機質碳、全磷和含水量極顯著正相關。朱平等［39］分析了祁連山中段墊狀植被、高寒草甸、沼澤草甸和高寒灌叢植被群落，發現土壤pH 是影響土壤細菌群落分布最主要的因子，本研究結果與之相反。pH 是大尺度上造成微生物群落差異的主要原因，張于光等［40］認為pH 是影響微生物海拔分布格局的主要原因。當pH 偏離中性，微生物群落會受到環境脅迫壓力［7］。本研究pH 介于6.8～7.3，趨于中性，故對土壤細菌群落結構無明顯影響。在本研究中有機質碳、全磷和含水量是微生物群落差異的驅動因子，也是造成沼澤化草甸與高寒草甸、人工草地微生物群落差異的主要原因。土壤有機碳與植被物種組成有關，不同的物種凋落物、根系分泌物為微生物提供了不同的碳源，由此導致細菌群落結構差異；其次含水量對細菌群落有影響，沼澤化草甸夏季雨后覆水，旱季淹水環境逐漸改善，但土壤通透性差且氧氣含量低，盡管高含量的土壤有機質、全氮、全磷、硝態氮和適宜的pH 值為土壤細菌提供良好的生存條件，但該環境不利于好氧微生物的生長。如在本研究中沼澤化草甸細菌屬水平上顯著富集的硝化螺旋菌屬、假單胞菌屬是對水生植物重要的細菌，參與多種生態反應。而在高寒草甸富集的細菌RB41、中慢生根瘤菌屬和慢生根瘤菌屬是變形菌門的一種與寄主植物共生的細菌，能將游離銨（NH4+）固定［41］。一般高寒草甸中豆科類物種豐度較大，可能是造成此類菌富集的主要原因。

4 結論

本研究利用高通量測序技術測定并揭示了祁連山高寒草甸、人工草地、沼澤化草甸土壤細菌群落結構，探討了土壤理化性質對細菌群落的影響。本研究發現細菌門水平上，3 地均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為主要類群，屬水平上表現出不同類型草地細菌富集類型不同。PCoA 分析顯示3 種草地類型細菌群落結構有差異，土壤有機質碳、全磷、土壤含水量與土壤細菌群落結構極顯著相關（P＜0.01），是影響3 種草地類型土壤細菌分布的主要因素。