生物炭、磷及AMF 對Cd 脅迫下柳枝稷生長及土壤性質的影響

孫紅 ，鄭玉龍 ，林炎麗 ，陳超 ，楊富裕 *

（1. 貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550000；2. 中國農業大學草業科學與技術學院，北京100089）

鎘（Cd）作為生物毒性最強的主要重金屬污染物，在我國污染土地面積已達2×107hm2［1-2］。Cd 對植物具嚴重的毒害作用：即抑制根系伸長生長、破壞葉綠素結構、抑制光合作用酶活性、引發氧化損傷、干擾營養元素吸收和運轉等［3-4］。Cd 通過食物鏈進入人體后，損害肝臟、腎臟等器官，已在全球范圍內引起諸多食品安全和人類健康問題［5］。因此，如何修復Cd 污染土壤已成為一個亟待解決的關鍵科學問題。

生物炭是各種有機物（家畜糞便、作物秸稈等）在厭氧條件下通過熱解、氣化和碳化過程獲得的副產物［6］，具有多孔、低密度、吸收面積大等特點［7］，其作為肥料添加到土壤中可提高土壤中碳（有機碳）、氮、磷含量，同時改善土壤的酸堿度、孔隙度和持水能力等理化特性［8-9］。在重金屬污染土壤中添加生物炭，可降低重金屬的生物有效性，減少植物對土壤中重金屬的吸收和轉運［10-11］。土壤中的磷（phosphorus，P）由于化學沉淀和吸附作用易被土壤固定，生物活性低；研究發現添加生物炭可提高土壤中P 的利用效率，減少農業生產中無機磷肥的施用量［12-13］。許多研究也將生物炭和無機磷作為土壤改良劑固定其中的重金屬離子，減少對植物的毒害作用［14-17］。

AMF 是與陸地上大多數植物形成共生關系的一類真菌，通過多種方式緩解重金屬對植物的毒害作用。一方面AMF 可提高植物養分吸收（特別是P 的吸收），促進其生長，稀釋重金屬在植物體內的濃度［18-19］；另一方面AMF 可將重金屬聚集在其叢枝結構、根外菌絲及孢子中［20-21］，或以多聚磷酸鹽的形式將重金屬螯合在液泡內［22-23］。因此，AMF 常作為一種生物肥料應用于重金屬污染土壤的修復中。但AMF 與植物在重金屬脅迫下的共生協同作用僅適于一定重金屬含量范圍內，超過一定閾值，植物提供的碳源不能滿足AMF 生長所需，菌根真菌開始與植物競爭光和產物，導致接種AMF 后對植物生長的促進作用不明顯［19］；前期研究也發現土壤中Cd 含量超過20 mg·kg-1時，接種 AMF 對能源草柳枝稷（Panicum virgatum）生物量無顯著促進作用［24］。

磷和生物炭的添加會影響AMF 與植物的親和性。低濃度磷有利于AMF 對植物根系的侵染，過高濃度則會抑制［25］；適度添加生物炭也有利于AMF 對植物根系的侵染和孢子的產生［26］。在重金屬污染土壤中，AMF 結合生物炭可改良土壤理化性質，降低土壤中重金屬的生物有效性，影響土壤微生物活性及豐度，降低重金屬對植物的直接傷害［27-28］。已有研究報道了生物炭、磷及AMF 互作對自然土壤、Cd 污染土壤中植物的生長、Cd 吸收特性及土壤性質的影響［15-16］。

目前，還未見相關報道涉及高濃度Cd 脅迫下，AMF 和生物炭、磷互作對柳枝稷生長，礦質元素吸收及土壤性質的影響。因此，本研究以前期試驗中對柳枝稷生長抑制作用較強的土壤Cd 含量（20 mg·kg-1）為基礎，研究AMF、生物炭、磷對柳枝稷生物量，P、Se、Cd 吸收以及土壤Cd 形態的作用，以期能夠找到提高柳枝稷修復重度Cd 污染土壤的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及生長基質

本試驗所用土壤采自于中國農業大學上莊試驗站，土壤類型為壤土，風干后過2 mm 篩。土壤化學性質為：pH：8.27，速效氮：50.56 mg·kg-1，速效磷：15 mg·kg-1，速效鉀：118.96 mg·kg-1，土壤有機質：1.13%，總 Cd 含量：0.27 mg·kg-1。細沙直徑小于0.5 mm，自來水清洗干凈后，用去離子水清洗3 次。按比例將土和沙子均勻混合（2∶1，w/w），經伽馬射線輻射滅菌（25 kGy，10 MeVelecton beam）。Cd 處理是在沙土混合物中加入 20 mg·kg-1的 Cd（以 CdCl2·2.5H2O 形式），穩定 50 d。本試驗 AMF 原始菌種（Rhizophagus irregularis，BGC AH01）由中國科學院生態環境研究中心提供。經過擴繁后接種物包括孢子、菌絲和植物根系的混合物，1 g 混合菌劑包含200個孢子。

1.2 試驗設計

設置 1 個 Cd 濃度水平（20 mg·kg-1）；2 個接菌處理：未接種 AMF（non-inoculation AMF，NM），接種 AMF（inoculation AMF，AM）；4 個外源處理：對照（CK）、生物炭（B）、磷（P60）、磷和生物炭混合（B+P60）。每個處理設置 3 個重復，共 24 盆。其中，CK 處理是添加 30 mg·kg-1磷（以 KH2PO4的形式）；B 處理是添加 30 mg·kg-1磷和4.5%的生物炭（w%），生物炭是由竹粉和豬糞混合高溫厭氧制成，由浙江省農業科學院土壤肥料所提供；磷處理是添加60 mg·kg-1的磷（P60），磷和生物炭混合處理是分別添加60 mg·kg-1磷和4.5%生物炭。各處理均是先將生物炭、磷添加到土壤中混合均勻，之后再進行接菌與植物移栽。將2.3 kg 土壤基質放入用次氯酸鈉消毒的花盆中（直徑19 cm×高17 cm），達到2/3 時，將25 g 菌劑均勻地鋪在上面，覆上剩余土壤。未接菌處理加入的菌劑在121 ℃烘箱中滅菌4 h。柳枝稷（Alamo）種子由中國農業大學動物科學技術學院育種試驗室提供。用10% H2O2將種子消毒20 min，自來水沖洗干凈后用去離子水沖洗3 遍，放在干凈培養皿中發芽至4 cm。將10 株幼苗移栽到土壤基質中，生長10 d 后間苗為5 株；為保持接菌與未接菌處理具有相同的土壤細菌，每個未接種處理中加入5 mL 過0.425 mm 篩網的菌劑濾液。每天用去離子水澆水，保持花盆土壤15%的含水量（55%的水保持能力）。該試驗于2017 年4-6 月在中國農業大學轉基因基地溫室中進行，在自然光條件下，溫室條件控制在16 h/30 ℃，8 h/22 ℃。

1.3 樣品采集及測定方法

移栽1 周后，每周各處理隨機選取3 株測定植株高度，共測定7 周。生長60 d 后用SPAD 502 葉綠素儀（SPAD-502PLUS，中國），自上往下取第3 片葉測定葉綠素相對含量（SPAD 值）。60 d 后將地上部和根系分開收獲，根系先用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗3 次。新鮮根系分為兩部分，一部分用于測定菌根侵染率，一部分烘干測定干重（在65 ℃下烘48 h）后粉碎，用于測定Cd，P，Se 含量。分別稱取0.3 g 干物質添加HNO3和H2O2（3∶1），利用微波消解儀（MarsX CEM，美國）經3 個加熱步驟消化制成消煮樣品；之后利用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）（model 7500，安捷倫科技有限公司，美國）測定消煮樣品中Cd、P、Se 含量。

采用2∶1 水土比（m∶v）測定土壤pH，采用Olsen 法測定土壤速效磷含量［29］，采用對硝基苯磷酸二鈉比色法測定土壤酸性磷酸酶活性［30］。利用改進后的BCR 連續提取法提取土壤中不同形態Cd［31］，用ICP-MS 測定Cd 含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0 軟件的three-ways ANOVA 分析生物炭、磷、AMF 及各處理互作對柳枝稷根系侵染率、SPAD、生物量、Cd、P、Se 含量及土壤pH 值、速效磷、土壤酸性磷酸酶活性和土壤不同Cd 形態含量的影響，如果不同處理在0.05 水平影響顯著，之后進行LSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 生長速率

接種AMF 兩周后各處理植株高度均高于未接菌處理（圖1）。4 個處理植株高度在接菌和未接菌處理下的變化趨勢基本一致，未接種AMF 植株高度變化趨勢為：CK＞P60和 B+P60＞B；接種 AMF 變化趨勢為：CK＞P60＞B+P60和 B。雖然接種 AMF 能顯著提高柳枝稷植株高度，但接種AMF 后柳枝稷高度在CK與B、P60及B+P60處理間無顯著差異。

圖1 不同處理下柳枝稷7 周內的植株高度Fig. 1 The plant height of switchgrass under different treatment for 7 weeks（mean±SD，n=3）

2.2 侵染率、SPAD 和生物量

磷添加顯著影響柳枝稷根系侵染率（P＜0.05），生物炭及與磷交互作用對菌根侵染率無顯著影響（P＞0.05）。接種AMF 顯著影響柳枝稷葉片SPAD 值、地上部和根系生物量（P＜0.05，P＜0.001），生物炭添加顯著影響根系生物量（P＜0.05），磷添加對上述指標無顯著影響（P＞0.05）（表1）。

表1 生物炭、磷及AMF 處理對測定指標的影響Table 1 Effect of biochar，phosphorus addition and AMF inoculation on parameters tested

P60處理根系侵染率達到56.9%，顯著高于CK，但與B 和B+P60處理差異不顯著。與CK 相比，B、P60和B+P60處理葉片SPAD、地上部和根系生物量無顯著變化，接種AMF 后各處理SPAD、地上部和根系生物量均顯著升高。CK+AM、B+AM、P60+AM 和B+P60+AM 處理下SPAD 比對應未接菌處理分別提高了14%、24%、7%和15%，其中B+AM 處理SPAD 顯著高于其他接菌處理；接種AMF 地上部生物量比對應未接菌處理分別提高了109%、1410%、214%和84%，根系生物量則分別提高了121%、608%、242%和129%，但接菌后各處理間生物量無顯著差異（表2）。

表2 不同處理下柳枝稷侵染率、SPAD 值和生物量Table 2 The root colonization，SPAD value and biomass under biochar，phosphorus addition and AMF inoculation treatments（mean±SD，n=3）

2.3 P、Se 和 Cd 含量

生物炭、磷及生物炭與AMF 互作顯著影響柳枝稷地上部P 含量（P＜0.05，P＜0.01）；生物炭和磷顯著影響地上部 Cd 含量（P＜0.001，P＜0.05），AMF 和 AMF 與磷、生物炭兩兩互作顯著影響地上部 Se、Cd 含量（P＜0.01，P＜0.001）。生物炭添加顯著影響根系P、Se、Cd 含量，AMF、AMF 與生物炭及與生物炭和磷三者互作也顯著影響根系P 含量（P＜0.01，P＜0.001）（表1）。

與CK 相比，除了根系B+AM、地上部和根系B+P60+AM 的P 含量顯著升高外，其他處理無顯著變化。但與未接種處理相比，接種AMF 顯著提高了B、P60處理地上部和根系P 含量。B、B+P60和P60+AM 地上部Se 含量與CK 無顯著差異，接種AMF 后CK、B 和B+P60處理地上部Se 含量顯著高于未接菌處理，分別提高了77%、280%和55%；與CK 相比，B+P60+AM 處理根系Se 含量顯著升高，而其他處理無顯著變化。地上部Cd 含量除了B 處理與CK 無顯著差異外，其他處理均顯著高于CK；接種AMF 后CK、B 和B+P60處理地上部Cd 含量高于未接菌處理，分別提高了116%、349%和13%。此外，B 和B+P60根系Cd 含量顯著高于CK 和P60處理，但各處理根系Se 和Cd 含量在接菌與未接菌處理間無顯著差異（圖2）。

圖2 不同處理下柳枝稷地上部和根系P，Se 和Cd 含量Fig. 2 P，Se and Cd concentration of switchgrass under biochar and phosphorus treatment，regardless of AMF inoculation（mean±SD，n=3）

2.4 土壤pH、速效磷和酸性磷酸酶活性

多因素方差分析表明：磷和AMF 交互顯著影響土壤pH 值（P＜0.05），生物炭添加顯著影響土壤速效磷含量（P＜0.001），磷添加顯著影響土壤速效磷和磷酸酶活性（P＜0.05）（表1）。無論是否接種AMF，各處理土壤pH值間無顯著差異。不同處理下土壤速效P 含量趨勢為：B+P60＞P60＞B＞CK，除了AM+P60處理的速效P 含量顯著低于未接菌處理（18%）外，其他處理在接菌與未接菌間無顯著差異。與CK 相比，只有B+P60處理土壤酸性磷酸酶活性顯著升高，其他處理無論是否接種AMF 均無顯著變化。AMF+CK 處理下的土壤酸性磷酸酶活性比未接菌處理升高了110%，AM+B+P60處理比未接菌處理顯著降低了51%（圖3）。

圖3 不同處理下土壤pH，速效磷含量和酸性磷酸酶活性Fig. 3 The soil pH，available phosphorus concentration and acid phosphatase activity under different treatment，regardless of AMF inoculation（mean±SD，n=3）

2.5 土壤不同Cd 形態

生物炭和磷添加顯著影響酸性提取態Cd 含量（P＜0.001，P＜0.05）；生物炭和磷、AMF 兩者交互及三者交互顯著影響還原態Cd 含量（P＜0.01，P＜0.001）；磷添加顯著影響氧化態Cd 含量（P＜0.05）；除生物炭和磷單獨作用外，AMF 及不同處理間的交互作用均顯著影響殘渣態Cd 含量（P＜0.01，P＜0.001）（表1）。無論是否接種AMF，各處理中酸性提取態和還原態Cd 含量變化趨勢相似：其中酸性提取態Cd 含量變化趨勢為：CK＞P60＞B和 B+P60處理；還原態 Cd 含量變化趨勢為：P60、B 和 B+P60＞CK；無論是否接菌，P60處理土壤中氧化態 Cd 含量保持在0.07 mg·kg-1，略高于其他處理。另外，接種AMF 顯著提高了CK、B、B+P60處理下的土壤中殘渣態Cd 含量，相比于未接菌處理分別升高了59%、53%、88%（表3）。

表3 不同處理下土壤酸性提取態、還原態、氧化態和殘渣態Cd 含量Table 3 The concentrations of acid-extractable Cd，reducible-Cd，oxidizable-Cd and residual-Cd in the soil under different treatments（mg·kg-1，mean±SD，n= 3）

3 討論

3.1 柳枝稷生長及養分吸收

生物炭是由有機物通過高溫裂解而制成，保留了原料中的大量和微量元素，因此，施加生物炭能夠提高土壤肥力而促進植物生長。Liu 等［15］和Xiao 等［16］研究發現單獨添加生物炭或磷顯著提高了Cd 脅迫下白三葉（Trifolium repens）、紫花苜蓿（Medicago sativa）的生物量，但本研究發現添加生物炭或磷并沒有促進柳枝稷的生長（表 2），可能是由于本研究中土壤 Cd 濃度為 20 mg·kg-1，遠高于之前報道的 Cd 濃度（1 mg·kg-1），從而導致生物炭和磷對柳枝稷的生長促進作用并不顯著。此外，本研究結果發現接種AMF 后無論是否添加生物炭或磷，柳枝稷地上部和根系生物量均顯著高于未接菌處理（表2）。大量研究已經證實AMF 與植物共生后一方面通過螯合物將重金屬螯合在細胞質或將其區隔在液泡、叢枝、菌絲結構中，降低重金屬對植物的直接傷害［20-22］，另一方面可提高植物根系對養分的吸收效率（特別是磷），促進植物生長，通過“稀釋效應”降低植物體內重金屬濃度［23-24］。本試驗也發現接種AMF 后所有處理（除了CK）的P 含量均顯著高于未接菌處理（圖2）。

Se 是植物必需的礦質元素之一，也是植物抗氧化系統中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）和其他硒蛋白的基本組成成分，在逆境條件下添加Se 可以促進植物體內形成GSH，提高植物抗氧化能力［25］。本試驗結果發現添加生物炭可顯著影響地上部Se 含量，表明生物炭中可能含有較高濃度的Se。此外，接種AMF后CK、B 和B+P60處理柳枝稷地上部Se 含量顯著高于未接菌處理，AM+P60表現出相反趨勢；同時各處理地上部Cd 含量變化與Se 相似，可能是因為接種AMF 后Se2+和Cd2+利用相同的離子載體進入植物體內，Se2+隨Cd2+的吸收和轉移可能也促進相應部位GSH 的合成，提高柳枝稷抗氧化能力。Durán 等［26］發現在干旱脅迫下萵苣（Lactuca sativa）接種AMF 后Se 含量與未接菌處理無顯著差異，可能與植物受脅迫程度及AMF 種類有關。Cd脅迫下，生物炭、AMF 與植物體內Se 吸收間的關系，是否會直接影響柳枝稷體內GSH 的活性，還有待于進一步研究。

3.2 Cd 含量、土壤特性及土壤Cd 形態

生物炭具有吸附表面積大和離子交換能力強和顯堿性的特點。之前研究發現添加生物炭能夠提高土壤pH，降低土壤Cd 活性［15-16，27］。但本研究發現添加生物炭對土壤pH 無顯著影響（圖3），可能是因為本試驗采用的土壤基質pH 為8.27，而之前報道的土壤pH 值低于7.5，表明生物炭對偏堿性土壤pH 值的影響可能弱于酸性或中性土壤。此外，本研究還發現添加生物炭后柳枝稷根系Cd 含量顯著高于CK（圖2），而之前報道發現添加生物炭可以降低植物地上部和根系Cd 含量［15-16，27］，一方面可能是因為本試驗中設置的Cd 濃度為20 mg·kg-1，遠高于其他報道的Cd 濃度（1、5、10 mg·kg-1），雖然生物炭對重金屬有一定的富集能力，降低了土壤中酸性提取態、還原態和殘渣態Cd 含量（表3），但在生物炭添加質量分數類似（3.0%、4.5%、5.0%）的條件下，其對Cd2+的吸附力有限，可能會導致土壤中剩余較多的Cd 進入柳枝稷根系蓄積，另一方面，制作生物炭采用的熱解溫度不同會影響有機官能團和CO32-比例，導致生物炭對重金屬吸收量產生差異［28］。

土壤中施加磷可以將土壤中活性態的Cd 轉化為磷酸鹽形態，降低Cd 的生物活性，進而減少植物中Cd 含量［32］；本試驗發現P60處理下地上部Cd 含量高于CK，根系Cd 含量與CK 無顯著差異；土壤速效磷和殘渣態Cd 含量顯著升高，表明施加磷可降低Cd2+的生物活性。接種AMF 也可以改變重金屬在植物組織中的吸收：接種AMF 后玉米（Zea mays）、柳枝稷地上部 Cd 含量降低［24，27］，而百脈根（Lotus corniculatus）、龍葵（Solanum nigrum）地上部和根系Cd 含量升高［19，33］，本試驗發現接種AMF 對不同處理地上部Cd 含量產生了不同效應：AMF+P60處理柳枝稷地上部Cd 含量低于未接菌處理，其他接菌處理均高于未接菌處理，可能是因為磷添加處理顯著影響了AMF 的侵染率，進而影響了菌根結構對 Cd 的螯合固定作用［20，34-35］。

土壤中施加生物炭可以增加酸性和中性土壤中的速效磷含量，提高土壤磷的可利用性［15-16，36］，本研究發現無論是否接種AMF，生物炭均可提高偏堿性土壤中速效磷含量（圖3），可能是因為生物炭自身磷含量及活性較高。土壤磷酸酶活性能夠在一定程度上表示土壤中P 的轉化效率及其對植物的有效性，缺磷環境下植物根系可直接分泌產生。接種AMF 后CK 處理的土壤酸性磷酸酶活性略高于未接菌處理，這與前期的研究結果相似［37-38］。AMF 自身也能產生一定量的酸性磷酸酶，提高土壤中酸性磷酸酶活性，促進植物對P 的吸收［39］。土壤磷酸酶活性只有在土壤P 含量不滿足植物生長時才會升高，如果P 含量過高會抑制植物絲氨酸蛋白磷酸酶基因的表達，進而降低土壤中磷酸酶活性［40］。磷酸酶活性與土壤磷含量緊密相關。AMF 結合B+P60處理的酸性磷酸酶活性反而比未接菌處理降低50%，其他處理下接種AMF 對土壤磷酸酶活性未產生顯著影響，推測可能是該處理下土壤P 含量和速效P 含量高于其他處理（圖3）。因此，在接種AMF 后應該根據土壤磷含量適度添加生物炭或磷，以進一步提高土壤P 的利用率。

重金屬的生物毒性受土壤重金屬總量和金屬種類的調控，重金屬種類影響金屬的生物可利用性。本試驗土壤中Cd 的主要存在形式為酸性提取態和殘渣態，與Chen 等［41］報道的結果相似。外源物質添加也會影響土壤中Cd 的形態及生物活性，本研究中無論是否接菌，磷、生物炭及二者混合處理下酸性提取態Cd 含量均顯著低于對照，而相應還原態Cd 含量略高于對照，表明生物炭和磷的添加有助于土壤中酸性提取態Cd 向還原態轉化。同時，AMF 也顯著影響土壤中殘渣態Cd 含量（表1），接種AMF 后CK、B 和B+P60處理下殘渣態Cd 含量顯著高于未接菌處理，表明AMF 能夠降低土壤中重金屬的生物活性。前期研究發現AMF 顯著影響土壤酸性提取態和還原態Cd 含量［24］，而本試驗結果發現AMF 顯著影響殘渣態Cd 含量，對其他形式的Cd 無顯著影響，可能是由于土壤Cd 濃度、土壤質地及柳枝稷品種的不同影響了其與AMF 的親和性，導致重金屬形態轉化產生差異。

4 結論

當土壤Cd 濃度為20 mg·kg-1時，單獨添加生物炭和磷對柳枝稷生物量無顯著影響，但接種AMF 后各處理生物量均顯著提高。單獨添加P60和B+P60及接種AM 時地上部Cd 含量均顯著升高，B 和B+P60處理根系Cd 含量顯著升高。生物炭、磷添加可顯著提高土壤速效磷含量。生物炭添加可顯著降低土壤酸性提取態Cd 含量，磷添加可顯著提高土壤還原性Cd 含量，接種AMF 顯著提高CK、B 和B+P60土壤殘渣態Cd 含量，但降低了P60殘渣態Cd 含量。綜上，AMF 結合生物炭和磷顯著提高柳枝稷生物量、Cd 含量及土壤殘渣態Cd 含量，促進了柳枝稷對Cd 的提取及土壤對Cd 的固定，可以在重度污染的Cd 土壤中應用。