三羧酸循環的代謝物與腫瘤發生相關性的研究進展*

魏晨 徐瑞華 鞠懷強

細胞代謝是一切生命活動的動力之源，為細胞的生長和增殖提供能量來源與物質基礎。在細胞代謝過程中，復雜多樣的代謝酶會產生大量的代謝產物小分子。這些小分子除了在經典的代謝途徑中發揮作用外，還作為信號分子發揮非代謝性的功能，將來源于細胞外的微環境因素和細胞內的基因表達信息聯系起來，對細胞的各種特性和進程產生影響，最終影響腫瘤的發生和發展。

線粒體是細胞能量代謝中心，在線粒體中發生的三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑。三羧酸循環的主要功能是產生還原當量，如NADH 和FADH2（由琥珀酸脫氫酶產生）。NADH 和FADH2 可將電子轉移到ETC 來驅動氧化磷酸化并生成ATP。突變的IDH 能消耗NADPH，將α-酮戊二酸轉化為D-2-HG，并生成NADP+。糖、脂肪、氨基酸分解代謝最終都將產生乙酰CoA，然后進入三羧酸循環進行氧化供能。同時，三羧酸循環也是糖、脂肪、氨基酸代謝聯系的樞紐，檸檬酸經載體轉運至胞質后在檸檬酸裂解酶作用下裂解成乙酰CoA 及草酰乙酸，乙酰CoA 隨后可被用于合成脂肪酸等。如圖1 所示，該循環由8 種酶組成，分別是檸檬酸合成酶（CS）、烏頭酸酶（ACO2）、異檸檬酸脫氫酶（IDH）、α-酮戊二酸脫氫酶（OGDH）、琥珀酰CoA 合成酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）、延胡索酸酶（FH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）。三羧酸循環的眾多中間代謝產物，作為內源生物活性小分子在腫瘤發生發展中所發揮的作用越來越受到關注。三羧酸循環衍生的代謝物主要包括琥珀酸鹽、延胡索酸鹽、D-2-羥基戊二酸、乙酰CoA 和NADPH 等，可對信號功能和細胞轉化的多個關鍵過程產生影響，與腫瘤發生發展密切相關。本文將依次探討琥珀酸、延胡索酸、2-羥基戊二酸、乙酰CoA 和NADPH 的非代謝功能，對這些三羧酸循環中間代謝物與腫瘤發生發展的研究進展進行綜述。

圖1 三羧酸循環

1 琥珀酸

琥珀酸由琥珀酰CoA 在琥珀酰CoA 合成酶的催化下生成，這是三羧酸循環中唯一的底物水平磷酸化反應，在水解琥珀酸的同時可生成ATP 或GTP。生成的琥珀酸將在SDH 的催化下生成延胡索酸。琥珀酸發揮其信號分子功能的過程主要涉及缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的穩定和蛋白質的琥珀酰化修飾[1]。

HIF-1α 作為缺氧條件下的重要轉錄因子，能在轉錄水平促進血管生成、細胞有氧呼吸向糖酵解的轉變及細胞的凋亡和自噬，并參與調節多條信號通路來促進腫瘤的增殖和轉移[2-3]。HIF-1α 蛋白通過羥基化、乙酰化、磷酸化等翻譯后修飾途徑及信號轉導途徑穩定其蛋白質結構并增強其活性。其中，脯氨酸羥化酶（PHDs）對HIF-1α 穩定性的調控至關重要。其使HIF-1α 的第564 位和第402 位的脯氨酸殘基羥基化，而HIF-1α 碳端存在富含脯/絲/蘇氨酸（Pro/Ser/Thr）的氧依賴降解結構域（ODDD），可與腫瘤抑制蛋白（pVHL）結合，聚集多種泛素蛋白，共同組成泛素連接蛋白酶復合體，從而將羥化的HIF-1α 亞基泛素化，并經泛素連接蛋白酶復合體途徑降解[4]。而PHD 屬α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶類，能將α-酮戊二酸（α-KG）轉化為琥珀酸，轉化的琥珀酸則會通過產物抑制作用，抑制PHD 來穩定HIF-1α[5]，從而促進腫瘤發生。最近有研究發現，癌細胞可以釋放琥珀酸，激活琥珀酸受體（SUCNR1）信號，并進一步通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-HIF-1α 軸促進腫瘤的遷移、侵襲和遠處轉移[6]。另外，琥珀酰化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾，可通過調控蛋白酶活性和基因表達，參與糖代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、酮體合成及活性氧清除等多種生命活動[7]。琥珀酰化修飾水平主要受琥珀酰基供體和琥珀酰基轉移酶/去琥珀酰化酶的調控，琥珀酰基供體及琥珀酰基轉移酶對琥珀酰化修飾發揮正向調控作用，去琥珀酰化酶對琥珀酰化修飾發揮負向調控作用。當琥珀酸脫氫酶缺失時，通過三羧酸循環產生的琥珀酰CoA 增多，核小體上的賴氨酸琥珀酰化修飾顯著增加[8]。實際上，組蛋白琥珀酰化的發生依賴于諸多催化酶，其中賴氨酸乙酰轉移酶2A 是組蛋白琥珀酰化修飾的轉移酶，可以利用琥珀酰CoA 作為底物，催化組蛋白H3K79 位點的琥珀酰化，進而促進癌基因轉錄，影響腫瘤的發生發展[9]。除組蛋白外，線粒體內的代謝酶也能發生琥珀酰化，如谷氨酰胺酶的琥珀酰化修飾能促進其由單體向有活性的四聚體轉換，提高催化活性，增強對谷氨酰胺的分解代謝和還原性物質的產生，從而對抗氧化應激，促進腫瘤細胞存活和腫瘤生長[10]。此外，大量的線粒體外琥珀酰化的發生表明，除琥珀酰CoA 外，琥珀酸或其他琥珀酸代謝產物也可以影響細胞質及細胞核的琥珀酰化水平[11]。研究發現琥珀酰化修飾與包括腸癌、肺癌、皮膚黑色素瘤、肝細胞癌等多種惡性腫瘤的發生相關，且在腫瘤中的作用具有組織異質性[12]。不同腫瘤中琥珀酰化水平差異的原因是什么，琥珀酰化修飾如何參與腫瘤的發生發展等問題還需進一步深入研究。

2 延胡索酸

延胡索酸最初在果蔬中發現，在三羧酸循環中，它由琥珀酸脫氫酶（SDH）催化琥珀酸氧化生成，同時也是酪氨酸分解代謝、尿素和嘌呤核苷酸循環的產物[13]。延胡索酸可以被延胡索酸酶（FH）水解進一步生成蘋果酸。除了代謝性功能以外，延胡索酸及FH對腫瘤發生發展的作用主要與其介導的氧化應激、甲基化修飾及DNA 損傷修復、細胞焦亡等密切相關。

鑒于延胡索酸在能量代謝中的核心作用，FH 曾被認為是一種管家酶[14]。但是，研究發現FH 的基因突變能導致遺傳性平滑肌瘤病與腎細胞癌[15]，并且FH 缺失的腎癌呈高度侵襲性，原發灶較小即能轉移，臨床預后很差。FH 缺失或失活突變將導致延胡索酸累積，研究發現延胡索酸可與細胞內的谷胱甘肽結合，從而破壞抗谷胱甘肽的抗氧化功能，升高活性氧水平導致氧化應激[16-17]。另有研究表明，延胡索酸會使鐵反應元件結合蛋白2（IRP2）琥珀酰化，促進轉鐵蛋白的轉錄[18]。這些都與代謝酶的催化功能無關，而是由延胡索酸的高水平積累所致，且不可逆。

當然，延胡索酸作為影響腫瘤微環境的線粒體信使，其功能多樣。FH 缺陷型腎細胞癌雖多表現出高頻拷貝數改變，但其體細胞突變負荷低，提示發病與表觀遺傳學機制相關[19]。最近的數據表明，延胡索酸是TET 依賴的DNA 去甲基酶家族和一系列組蛋白去甲基化酶的有效抑制劑[20-21]。延胡索酸的積累能夠抑制具有抗腫瘤轉移作用的miR200 家族的miRNAs 發生TET 依賴性DNA 去甲基化，促進上皮-間質轉化（EMT），該過程涉及癌癥的發生和轉移[22-23]。另外，FH 的酶活性及其產物延胡索酸是DNA 損傷反應的關鍵元件，FH 缺陷可通過破壞DNA 損傷修復來促進腫瘤生長[24]。焦亡（pyroptosis）是炎癥性細胞死亡類型之一，在自身免疫性疾病及腫瘤中都發揮重要作用。細胞焦亡過程中的明星分子Gasdermin 家族成員GSDMD 和GSDME可被代謝過程產生的延胡索酸在特定半胱氨酸位點加上2-琥珀酰基（succinyl）修飾，從而抑制其形成寡聚體，阻止焦亡的發生[25]。因此，延胡索酸積累激活的下游分子與信號通路，有望作為腫瘤治療的潛在靶點。

3 D-2-羥基戊二酸

2-羥基戊二酸是一種α-羥基酸，存在兩個同分異構體-D-2-羥基戊二酸（D-2-HG）和L-2-羥基戊二酸（L-2-HG）。正常情況下，哺乳動物細胞中微量的2-HG分別由蘋果酸脫氫酶（MDH）和羥基酸-含氧酸轉氫酶（HOT）催化生成[26]。在生理條件下，IDH1/2 負責將異檸檬酸氧化為α-KG，為機體提供生物合成的原料和能量，同時伴隨生成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）對于維持細胞氧化還原環境的平衡起到至關重要的作用。研究發現，突變型IDH1/2（mIDH1/2）能夠將α-KG 轉化為致癌代謝物D-2-HG，并通過表觀遺傳調控的改變促進腫瘤發生發展[27-29]。

近年來，在不同類型的腫瘤細胞中發現了IDH1/2突變，并證實突變產生過量的D-2-HG 是導致腫瘤發生和發展的根本原因，以膠質瘤、軟骨瘤、急性髓細胞白血病和肝內膽管癌最為常見[11]。D-2-HG 在結構上與α-KG 相似，其發揮α-KG 拮抗物作用，競爭性抑制多個α-KG 依賴的雙加氧酶，包括KDMs 和TET DNA羥化酶家族。在膠質瘤和肝內膽管癌中，mIDH1/2 產生的D-2-HG 能驅動CpG 島甲基化表型而促進腫瘤發生，高濃度的2-HG 抑制了TET 酶的活性，致使CCCTC-結合因子（CTCF）結合位點表現出廣泛的高甲基化狀態，表觀遺傳調控異常，進而誘導抑癌基因沉默、抑制細胞分化、促進細胞增殖，最終導致腫瘤的發生與發展[30-33]。在低級別膠質瘤中mIDH1 產生的D-2-HG 還可以通過抑制組蛋白去乙基化酶KDM4A，使mTORC1/2 的負向調節因子-DEPTOR 不穩定，從而激活mTOR 信號通路，促進腫瘤的發生發展[34]。

除了導致表觀遺傳的失調控，D-2-HG 還能增加HIF-1α 蛋白的穩定性。IDH1/2 突變產生的D-2-HG抑制了α-KG 依賴性的雙加氧酶PHDs 的活性，使HIF-1α 不被泛素化降解，從而穩定HIF-1α 蛋白，而HIF-1α 穩定性增加的現象已經在IDH1 突變的腦組織中得到證實[35]。值得一提的是，突變的IDH 過度消耗細胞內NADPH 也會導致ROS 增多，使細胞更容易受到ROS 的損傷，引起細胞膜破壞、DNA 損傷和基因組的不穩定，導致腫瘤的形成。另外，D-2-HG 的作用不僅局限于對細胞表觀遺傳水平的調控，越來越多的研究表明其在細胞內的濃度往往與免疫系統正常功能的發揮密切關聯。現已證明，D-2-HG 可能通過抑制補體激活和T 淋巴細胞活化等過程，促進IDH1/2 突變型膠質瘤的免疫逃逸[36]。在鐵死亡領域，mIDH1 產生的D-2-HG 還可以通過下調谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）蛋白水平，使細胞內脂質過氧化物累積，增加癌細胞對鐵死亡的敏感性[37]，這對未來癌癥治療方法的創新有著重要意義。

4 乙酰CoA

乙酰CoA 可通過糖酵解來源的丙酮酸脫羧、脂肪酸β 氧化和氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸的降解而產生[13]。三羧酸循環中，乙酰CoA 為草酰乙酸到檸檬酸的生成提供乙酰基。乙酰CoA 不能直接透過線粒體膜，而是以檸檬酸的形式經線粒體檸檬酸鹽載體離開線粒體到達胞質，隨后被ATP-檸檬酸鹽裂解酶（ACL）裂解，再度轉化為乙酰CoA 和草酰乙酸。哺乳動物細胞中組蛋白乙酰化依賴于ACL 裂解檸檬酸生成的乙酰CoA，而抑制ACL 則會降低組蛋白乙酰化水平[38]。在糖剝奪條件下，核轉位的CoA 合成酶2（ACSS2）能夠在核內局部催化CoA 的生成，并可通過增加溶酶體生物發生及自噬相關基因啟動子區的組蛋白3 乙酰化水平，促進其表達，此過程與人神經膠質瘤的侵襲性增加相關[39]。事實上，除了組蛋白乙酰化，非組蛋白乙酰化也涉及生理和疾病相關的關鍵細胞過程，如基因轉錄、DNA 損傷修復、細胞分裂、信號轉導、蛋白質折疊、自噬和新陳代謝等。乙酰CoA 還可以通過激活鈣/鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)促進前列腺癌遠處轉移[40]。因此，乙酰CoA 參與的乙酰化修飾能夠通過多種機制影響蛋白質功能，包括調節蛋白質穩定性、酶活性、亞細胞定位以及通過調控蛋白質與蛋白質、蛋白質與DNA 相互作用等，從不同的維度調控腫瘤的發生發展。

5 NADPH

NADPH 即還原型輔酶Ⅱ，其來源除了三羧酸循環中的異檸檬酸脫氫酶以外，主要還包括蘋果酸酶、戊糖磷酸途徑和葉酸代謝途徑。NADPH 可作為供氫體為細胞的合成代謝（如脂肪酸、核苷酸的合成等）提供還原電子對。NADPH 還可以作為谷胱甘肽的輔酶，是細胞內抗氧化防御系統的重要組分，在維持腫瘤細胞內的氧化還原穩態，防御活性氧損傷方面發揮關鍵的作用[41-42]。最近研究發現，NADPH 通過與第二信使Ins(1,4,5,6)P4 競爭性結合組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3），阻礙HDAC3-Ncor 復合物的形成，從而抑制HDAC3 的活性，增加組蛋白乙酰化水平[43]。這說明NADPH 不但可以抵御氧化應激，還可以作為信號分子參與表觀遺傳狀態的調控，HDAC3 也可以作為細胞內NADPH 穩態的感受器，通過感知細胞內NADPH 的水平，調控組蛋白乙酰化和基因表達。

6 結語

目前關于代謝物作為信號分子的研究雖已取得較多進展，如延胡索酸鹽作為促腫瘤信號分子、乙酰CoA 參與調控表觀遺傳促進腫瘤發生發展等研究，為這一新興領域增添了新的內容，但仍然有諸多問題亟待探索，如琥珀酸等是否可以作為疾病或腫瘤進展的生物標記或驅動因素，積累的代謝產物在細胞中如何分布，這些細胞如何以旁分泌的方式釋放信號等。考慮到代謝酶和代謝小分子能夠發揮多種調節作用的特點，以腫瘤代謝為靶標開發新型的腫瘤治療藥物，將會成為未來腫瘤治療領域新的研發熱點，對于某些腫瘤的治療有可能產生重大的突破。