黑枸杞花青素對巨噬細胞RAW264.7 炎性與自噬交互作用的影響

薛才華，武 強，王夢杰，劉嘉華，張龍飛，張家瑋，吳 華

（青海大學農牧學院，青海西寧 810016）

炎癥是指機體受到外界刺激后，通過系統本身的活體組織對外界致炎因子產生的一種防御作用。巨噬細胞作為免疫系統的重要組成成分，參與機體的特異性免疫與非特異性免疫，在炎癥反應及疾病的發生發展過程中發揮著重要作用[1]。TLR4/NF-κB 信號通路是細胞識別病原激活免疫反應的一條經典信號通路，也是多種藥物治療炎癥、免疫相關疾病的作用靶位[2-3]。細胞自噬是真核生物進行自我保護的一種機制，主要是通過溶酶體對細胞內的蛋白質和細胞器進行融合降解從而達到細胞穩態[4]。其中mTOR 信號通路是最常見的自噬調節通路之一，mTOR 介導的信號通路是調控細胞能量和營養代謝的重要樞紐。

黑枸杞花青素是從黑枸杞中分離提取出來的一種紫紅色素，屬于類黃酮類物質。黑枸杞花青素在細胞免疫上，具有增強淋巴細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的功能[5]。研究發現，細胞內的信號通路之間并非各自獨立、單一地執行某種功能，而是存在著許多“對話”，并相互交匯形成復雜的信號網絡[6-7]，對細胞的各項生命活動進行精準調控。細胞自噬參與眾多固有免疫信號的調控，本文基于自噬調控通路mTOR 通路來研究黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路的影響，為黑枸杞資源的深度開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 小鼠巨噬細胞株RAW264.7 購買于中國科學院上海細胞庫；黑枸杞花青素購于青海金麥杞生物科技有限公司（花青素61%、灰分0.6%、蛋白質6%、糖1.32%、氨基酸3.56%）[8]；DMEM 干粉和胎牛血清購自于Gibco 公司；PBS 購自Hfart 公司；胰蛋白酶溶液和BCA 蛋白定量試劑盒購自Solarbio 公司；雷帕霉素（RAPA）購自MedChemExpress 公司；TRNzol Universal 總RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒和SuperReal 彩色熒光定量預混試劑盒均購自天根生化科技有限公司；山羊抗IgG 購自Abcam 公司；NF-κBp65抗體和p-NF-κBp65 抗體購自北京博奧龍免疫技術有限公司；p-mTOR 購自SAB 公司；Ant-GAPDH 購自Immunoway 公司。

1.2 試驗儀器 超凈工作臺（江蘇通凈凈化設備有限公司）；CO2細胞培養箱（美國NUAIRE 公司）；高速低溫離心機（英國Dynamica 公司）；PCR 儀及熒光定量系統（BIO-RAD）；Western blot 轉膜儀，Western blot 電泳儀及Western blot 電源（北京六一生物科技公司）；搖床（美國SCILOGEX 公司）；化學發光成像儀（北京賽智科技有限公司）。

1.3 試劑配制 花青素溶液的配制：準確稱取0.01 g 花青素溶于10 mL DMEM 培養基中，配成1 mg/mL 的花青素母液，-20℃保存，使用前稀釋成相應濃度。

LPS 溶液的配制：將1 mg LPS 粉末溶解于10 mL的PBS 溶液中，配制成100 μg/mL 的LPS 母液，分裝后保存于-80℃冰箱，使用前稀釋成相應濃度。

雷帕霉素抑制劑的配制：精確稱取0.0914 g 雷帕霉素粉末加入1 mL 的PBS 溶液，配制成濃度為100 mmol/L的母液稀釋使用，置于-20℃冰箱保存，試驗中雷帕霉素的最終濃度為100 nmol/L。

BAY11-7082 抑制劑的配制：精稱量0.0207 g BAY11-7082 溶入到1 mL PBS 中配制成100 mmol/L 的BAY11-7082溶液，取1μL 的BAY11-7082溶液加入到999 μL PBS 中，配制成100 μmol/L 的BAY11-7082 母液，然后將所有濃度的BAY11-7082 溶液置于-20℃冰箱保存。

1.4 細胞培養及分組 將小鼠巨噬細胞RAW264.7 置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，用含10%胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養液進行培養，每24 h換1 次液，待細胞生長70%～80%融合時將其傳代，取處于對數生長期的細胞用于試驗細胞分為對照組、花青素組（25 μg/mL）、脂多糖組（1 μg/mL）、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）組、脂多糖（1 μg/mL）+雷帕霉素（100 nmol/L）組、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）+雷帕霉素（100 nmol/L）組、脂多糖（25 μg/mL）+BAY11-7082（20 μmol/L）組、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）+BAY11-7082（20 μmol/L）組。

1.5 實時熒光定量PCR 按上述分組進行試驗，以細胞濃度為1×106接種至6 孔細胞培養板后常規培養，待細胞達到70%～80% 融合時分組處理，每組3 個重復。根據反轉錄試劑盒的操作步驟，將RNA 反轉錄成cDNA。之后使用熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR 反應，使用上海生物公司設計合成的引物，如表1 所示。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

表1 相關因子引物序列

1.6 Western Blot 檢測相關因子蛋白表達 按上述分組進行試驗，處理完各組細胞后，分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。用30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL 蛋白樣本混合于200 μL 離心管中，于PCR 儀上變性后泳道上樣，經 SDS-PAGE 電泳后，半干轉膜至PVDF 膜，按比例配制 NF-κBp65 抗體、p-NF-κBp65 抗體、p-mTOR抗體及 GADPH 抗體，4℃封閉過夜，TBST 洗膜，室溫5×6 min 搖洗，加入山羊抗IgG 二抗，室溫1 h 后TBST 洗膜，室溫5×6 min 搖洗。將保鮮膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，將PVDF 膜正面（蛋白附著面）朝上，放置于薄膜里。將發光液試劑盒中兩種液體按1:1 比例混合，搖勻。滴加到PVDF 膜上，反應5 min。用鑷子夾起PVDF 膜一角，使發光液自然流下，曝光顯影觀察。

1.7 統計分析 采用Image J 對條帶量化，所有試驗數據經Excel 軟件初步處理后，所有數據采用 SPSS25.0 One-Way ANOVA Duncan's 法進行分析，計量資料采用平均數± 標準差表示。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結果

2.1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路的影響。

2.1.1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路相關因子mRNA 表達的影響 如圖1 所示，對照組相比，脂多糖組的TLR4、NFκB、TRAF6和MyD88的mRNA 表達均提高（P＜0.01）；當mTOR 被抑制后，與脂多糖+雷帕霉素組對比，花青素+脂多糖+雷帕霉素組的TRAF6mRNA 表達水平減低（P＜0.05）。

圖1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對TLR4、NF-κB、TRAF6、MyD88 mRNA 表達水平的影響

2.1.2 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路關鍵因子蛋白表達的影響由圖2 可知，與對照組相比，脂多糖組的NF-κBp65 和p-NF-κBp65 的蛋白表達水平提高（P＜0.01）；當mTOR被抑制后，與脂多糖+雷帕霉素組對比，花青素+脂多糖+雷帕霉素組的NF-κBp65 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。

圖2 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對NF-κBp65 和p-NF-κBp65 蛋白表達的影響

2.2 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對mTOR 通路的影響

2.2.1 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對自噬相關因子mRNA 表達的影響 由圖3 可知，與對照組相比，脂多糖組Beclin1、LC3和ULK1的mRNA 表達提高（P＜0.01），mTORmRNA 表達降低（P＜0.05）；當NF-κB 被抑制后，與脂多糖+BAY11-7082 組對比，花青素+脂多糖+BAY11-7082 組mTOR和ULK1的mRNA表達水平降低（P＜0.05）。

圖3 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對自噬相關基因 mRNA 表達的影響

2.2.2 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對mTOR 通路關鍵因子蛋白表達的影響 由圖4 可知，與對照組相比，脂多糖組p-mTOR 蛋白表達降低（P＜0.05）；當NF-κB 被抑制后，與脂多糖+BAY11-7082 組對比，花青素+脂多糖+BAY11-7082 組的p-mTOR 的蛋白表達水平降低（P＞0.05）。

圖4 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對p-mTOR 蛋白表達的影響

3 討 論

巨噬細胞是參與機體免疫應答反應的重要成分，在多種疾病中有效發揮其吞噬作用，是機體抵御細菌感染和癌癥的第一道防線。因此，巨噬細胞在啟動適應性免疫應答中扮演著重要的角色并參與自身免疫性疾病、感染和炎癥性疾病的發病機制[9]。LPS 為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細胞產生過量的炎癥介質（如NO 和TNF-α）以及炎性細胞因子（如IL-1β和IL-6），這些物質通過與其他炎癥介質的協同作用促進過敏性哮喘等炎癥性疾病的發生與發展[10-12]。TLR4/NF-κB 通路是炎癥信號傳導途徑中的重要通路之一，TLR4 被激活后可經MyD88 依賴性途徑和TRIF 依賴性途徑傳導信號激活NF-κB，從而誘導細胞因子等免疫相關分子的表達。NF-κB 是一種核轉錄因子，通常以p65和p50 2 個亞基形成異二聚體的形式普遍存在于真核細胞中，其中p65 亞基磷酸化是NF-κB 活化并啟動下游基因表達的必要條件[13]。NF-κB 可調控多種細胞因子的轉錄表達，在細胞的增殖、分化、凋亡和自噬等生命活動中發揮著重要作用。TLR4 是細胞自噬的一個感受器，自噬是TLR4 受體激活后產生的一個效應機制。自噬是巨噬細胞吞噬和清除體內病原微生物的重要調控機制，有研究[14]表明，巨噬細胞的自噬功能下降可以降低其對體內凋亡細胞吞噬的效率。mTOR 是由高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，它的主要作用是調控細胞的生長和新陳代謝[15-16]。當細胞在營養缺乏、新陳代謝紊亂、炎癥反應及外界壓力的刺激下，細胞會產生相應的應激反應，mTOR 的活性會降低，同時激活細胞的自噬；當細胞營養充足時，mTOR 活性又會被激活，從而抑制細胞自噬[17]。研究發現，細胞內的信號通路之間并非是獨立的，而是相互交匯的，并且形成了復雜的信號網，細胞自噬參與眾多固有免疫信號的調控，在固有免疫的調控中，自噬mTOR 通路對TLR4/NF-κB 通路的調控起著重要作用[18]。Mojgan 等[19]研究發現NF-κB 的活化可抑制TNF-α 誘導的細胞自噬，這一作用與mTOR 調控信號分子有關。本試驗結果顯示，與對照組相比，脂多糖組上調了TLR4、NF-κB、TRAF6、MyD88、LC3、ULK1和Beclin1的mRNA 表達及NF-κBp65 和p-NF-κBp65 的蛋白表達，說明脂多糖在誘導小鼠RAW264.7 細胞發生自噬的同時也激活了TLR4/NF-κB 信號通路。當mTOR 被抑制時，脂多糖對NF-κBp65 磷酸化水平較抑制前明顯降低，而在mTOR被抑制后黑枸杞花青素對NF-κBp65 磷酸化水平沒有明顯的影響；當TLR4/NF-κB 通路被阻斷后，LPS 誘導的自噬水平較抑制前顯著降低，此時黑枸杞花青素下調LC3、ULK1、Beclin1和mTOR的mRNA 表達及p-mTOR的蛋白表達。這一結果說明黑枸杞花青素具有抑制巨噬細胞自噬的功能且LPS 對TLR4/NF-κB 的激活受到mTOR 的調控，mTOR 通路可能是自噬調節炎癥的免疫信號途徑。

4 結 論

本試驗結果顯示，黑枸杞花青素對LPS 誘導的炎癥具有保護作用，且TLR4/NF-κB 通路的激活受mTOR的調控，mTOR 通路可能是自噬調節炎癥等免疫反應的信號途徑。