枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物對鯉魚生長性能、血清生化指標、免疫指標及抗氧化功能的影響

王紅濤，馮 穎，明美玉，陳之恒，宋婧婧，孫 瑩，肖 智

（通化師范學院生命科學學院，吉林通化 134002）

近年來，水產養殖環境日益惡化，導致養殖動物的病害甚至重大疾病頻發。由于傳統抗菌藥物具有在動物體內殘留、引起病原菌的耐藥性等缺點，而水生食品的安全問題也備受關注。現如今，中草藥和益生菌作為兩大類新型飼料添加劑，均具有無毒害、無藥殘、功能全面等優點[1-2]，已得到廣泛關注并成為研究熱點。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是水產養殖中常用的優勢益生菌之一，不僅可以促進機體對營養物質的吸收，促進機體產生各種消化酶，提高飼料利用率，促進動物生長發育，提高免疫功能，還具有抑制致病菌群的生長繁殖、維持腸道微生態平衡等多種功能[3-4]；蒲公英屬菊科多年生草本植物，為藥食同源藥材[5]，其提取物中含有蒲公英醇、多糖類、有機酸、生物堿及皂苷等多種活性成分，具有調節機體免疫、保護肝臟、降血糖、抗氧化等生物功能[6]。近年來，已有研究表明，蒲公英及其提取物作為飼料添加劑，廣泛應用于魚[7]、雞[8]及豬[9]等動物中，可直接補充物質能量，促進動物食欲、增強機體抵抗力，還可通過預防疾病來確保動物健康生長[7]。

飼料中添加中草藥和益生菌可使兩者發揮協同作用優勢。然而，目前關于將枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物復配應用到魚類飼料中的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在探討日糧中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物對鯉魚生長性能、血清生化指標、免疫指標及抗氧化功能的影響，為枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物二者復合在魚類生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 枯草芽孢桿菌由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心提供。在使用之前，采用振蕩器在30℃有氧條件（150 r/min）LB 培養基中培養18 h，備用，其中枯草芽孢桿菌活菌數為2×107CFU/g。

全株蒲公英樣品購買于西安圣青生物科技有限公司，參考吳曉麗等[10]方法制備蒲公英提取物，提取物主要組成為總黃酮和多糖，其含量分別為5.51% 和14.91%。

1.2 試驗設計 選取720 條健康無病、初始體重（31.56±2.31）g 和體長（16.78±0.96）cm 的鯉魚（吉林省通化市某水產養殖廠），預試驗為14 d，正式試驗周期為56 d。飼養于室內玻璃水族箱（1 m×0.5 m×0.5 m）中，每個魚池中放養30 條，隨機分為4 組，每組6 個重復。對照組飼喂基礎日糧，試驗組分別在基礎日糧中添加2×107CFU/g、100 mg/kg 蒲公英提取物、2×107CFU/g枯草芽孢桿菌+100 mg/kg 蒲公英提取物，添加量參照前人研究結果[11-12]飼喂，各組間飼養管理無差異，基礎日糧組成及營養成分見表1。試驗原料經粉碎過120 mm 目篩。在冷卻條件下，將枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物復配與基礎日糧分混合，制成直徑為2.0 mm 的顆粒，存放在4℃冰箱中備用。預試期為14 d，正試期為56 d。

表1 基礎日糧組成及營養成分

1.3 飼養管理 各組飼養管理一致。試驗期間，水溫控制在（22.5±2.0）℃，溶解氧為（6.05±0.14）mg/L，pH 為（7.53±0.02），亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，每天換去水族箱內1/3 水并換洗濾布。日投喂量為每組魚總重的2%，每天2 次（09:00，16:00）向魚提供飼料。自然光周期（約13 h 光照:11 h 黑暗）。

1.4 樣品采集 試驗結束時，將魚禁食24 h，然后再收集樣品，從每組中隨機取12 條魚，用注射器尾靜脈采血，4℃靜置2 h，待血液凝固析出血清后，用冷凍離心機4℃、8 000 r/min 離心20 min，分離出血清，用于測定血清生化指標。將魚采血后立即剖開腹部，剝離出肝臟并稱重，用生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，肝臟和生理鹽水按1:9（m/V）的比例冰浴勻漿，用冷凍離心機4℃、8 000 r/min 離心20 min，取上清液測定抗氧化指標。試驗魚用300 mg/L 的甲烷磺酸鹽222（MS-222）安樂死，將所有樣品冷凍在液氮中，并在-80℃下保存直至試驗測定。

1.5 指標測定及方法

1.5.1 生產性能 試驗初始和試驗結束時，將試驗魚禁食24 h，統計每組存活條數，測量每組標記魚的體重和體長，記錄投料量和采食量，生長性能指標計算公式：

增重率（WGR）=（最終均重－初始均重）/初始均重×100%

特定生長率（SGR）=100%×（ln 最終長度－ ln初始長度）/天數

肥滿度（CF）=最終重量/最終體長 ×100%

存活率（SR）=最終條數/初始條數×100%

飼料系數（FCR）=飼料攝入量/（最終總重量－初始總重量）

1.5.2 血清生化指標、免疫指標 總蛋白（TP）采用雙縮脲法，白蛋白（ALB）采用溴甲酚綠法，球蛋白（GLB）采用酶聯免疫法，甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）采用酶終點比色法，血糖（GLU）采用己糖激酶法，肌酐（Cr）采用堿性苦味酸法，堿性磷酸酶（ALP）活性采用AMP 緩沖液法，谷丙轉氨酶（ALT ）、谷草轉氨酶（AST）采用酶連續測定法，均使用全自動生化分析儀進行檢測。

免疫球蛋白IgM 采用酶聯免疫吸附法（ELISA），補體3（C3）和補體4（C4）采用免疫透射比濁法，血清溶菌酶（LSZ）含量采用比濁法，均使用全自動生化分析儀進行檢測。

1.5.3 肝臟抗氧化指標 谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定，并嚴格按照試劑盒的操作說明進行。

1.6 統計分析 試驗數據采用Excel 2007 處理及SPSS 20.0 統計軟件進行方差分析，用Duncan's 法進行多重比較，試驗結果采用平均值± 標準差表示。當P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚生長性能的影響 由表2 可知，枯草芽孢桿菌組+蒲公英提取物組WGR 高于其他各組（P＜0.05）；此外，枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組WGR 之間差異不顯著。枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組FCR 分別比對照組、枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組降低39.63%、21.23%、10.35%（P＜0.05）。各組SGR、CF 和SR 之間無顯著差異，但枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組魚的FBW 高于其他各組（P＜0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚生長性能的影響

2.2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚血清生化、免疫指標的影響 由表3 可知，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復合組的TP、GLB 和TG 含量與對照組均無顯著差異，各試驗組ALB 含量均高于對照組（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組GLU 含量低于對照組（P＜0.05），而枯草芽孢桿菌組GLU 含量略低于基礎日糧組（P＞0.05），枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組血清中CHO 濃度較對照組分別降低25.98%、31.52%、38.25%（P＜0.05），蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物組Cr 含量較對照組均降低（P＜0.05），各組間鯉魚ALP 活性均無顯著性差異，3 個試驗組與對照組相比，血清ALT、AST 含量均降低（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組差異不顯著，且枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組魚的血清ALT 含量最低。

表3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚血清生化指標的影響

由表4 可知，與對照組相比，3 個試驗組魚的免疫球蛋白IgM 含量、血清LZM 均提高（P＜0.05），C3、C4 活性均增加（P＜0.05），其中枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組各指標含量最高。

表4 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚免疫指標的影響

2.3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚肝臟抗氧化功能的影響 由表5 可知，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復合組魚肝臟MDA 含量均較對照組降低（P＜0.05），且GSH-Px、GST、CAT 活性高于對照組；枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組的T-AOC、SOD 活性高于其他組（P＜0.05），枯草芽孢桿菌組與蒲公英提取物組間無顯著性差異。

表5 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚肝臟抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚生長性能的影響 本試驗結果表明，鯉魚飼料中添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復合物 均可提高鯉魚的WGR，使其FCR 降低，從而提高了飼料轉化率，而兩者復合使用效果更顯著，說明飼料中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英對鯉魚的生長具有促進作用。趙倩等[13]研究也表明，在鯉魚日糧中添加2%、3% 枯草芽孢桿菌發酵中藥制劑可顯著提高鯉魚的生長性能。枯草芽孢桿菌也是鯉魚腸道內重要的益生菌。在鯉魚日糧中添加枯草芽孢桿菌提高了鯉魚腸道菌群豐度，并降低有害菌數量，從而改善鯉魚腸道健康，提高了腸道的營養利用率，進而提高了鯉魚的生長性能[14]。何偉聰等[15]研究也表明，投喂枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌混合物為2×107CFU/g 時，軍曹魚幼魚增重率明顯提高，飼料系數顯著低于對照組。研究發現，蒲公英提取物能夠促進鯽魚生長，提高鯽魚消化道內胃蛋白酶和淀粉酶活性[12]。此外，本研究結果還表明，枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物對鯉魚飼料轉化率的提高優于單獨添加。

3.2 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚血清生化、免疫指標的影響 血清生化指標常用來評價魚體健康和營養狀況等，血清TP、ALB、GLB、TG、GLU、CHO含量可以反映機體蛋白質、脂類吸收與代謝狀況[16]。血清TP 包括ALB 和GLB，血清ALB 維持血漿膠體滲透壓，GLB 參與機體特異性免疫，在機體中具有重要的生理功能[17]。不同濃度的枯草芽孢桿菌發酵中藥制劑可以提高鯉魚TP 含量[13]。本試驗發現，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及兩者復配組TP 含量與與對照組無顯著差異，這一結論與前人研究結果不同，這可能是本研究所使用的為枯草芽孢桿菌，而其他研究所使用的為枯草芽孢桿菌中藥制劑，其中含有一些特殊成分，而導致鯉魚血清中TP 含量升高。彭小玉等[12]研究表明，日糧中添加蒲公英提取物可顯著改善鯽魚生長性能，但對鯽魚血清TP、TG 含量均無顯著影響，此研究結果與本試驗結論相似。本試驗結果發現，單獨添加枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物、兩者復合物均使GLU 濃度降低，而蒲公英提取物組和兩者復合組GLU 濃度下降更顯著，這與蒲公英提取物具有降血糖作用[18]基本一致，推測蒲公英提取物具有降血糖作用，可能是由于減少了腸道吸收GLU 入血，且枯草芽孢桿菌對機體糖類代謝有調節作用。本試驗結果顯示，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組、枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物組鯉魚血清中CHO 濃度均顯著降低，可能是由于蒲公英提取物中含有低聚糖。有研究發現低聚糖能有效降低CHO 含量[19]。李美菊[7]研究發現，蒲公英提取物能使CHO 濃度降低，改善羅非魚血液生化指標，與本研究結果基本一致。Cr為肌酸的代謝產物，主要由腎小球濾過后排出體外，當腎功能發生明顯障礙時，肌酐含量上升[20]，本研究結果表，試驗組Cr 含量略低于對照組，表明枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及二者復合對魚體腎功能無損傷作用。ALP 是一種非特異性表達的酶，也是機體生命活動的基礎酶[21]。本試驗中，枯草芽孢桿菌組、蒲公英提取物組及二者復合組ALP 活性與對照組均無顯著性差異，這表明添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物以及二者復配物不會對鯉魚機體健康帶來不利影響。本試驗研究結果表明，在日糧中添加枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及二者復合均可明顯提高鯉魚LSZ 活性，從而增強機體非特異性免疫的功能，與前人研究結果[11]一致。AST、ALT 是反映肝功能的2 種重要指標[22]。本試驗研究顯示，在飼料中添加枯草芽孢桿菌和蒲公英提取物可顯著降低鯉魚AST、ALT。李樹鵬等[23]研究發現，與對照組相比，黃芪多糖、益生菌和合生元組21 日齡和42 日齡雛雞的AST 均下降。血清IgM、C3、C4 及LZM 是反映動物機體非特異性免疫功能的重要指標[24]。本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物可顯著提高鯉魚血清IgM 含量，表明其可增強鯉魚的免疫功能；各試驗組血清C3、C4 含量顯著高于對照組。程遠等[25]研究也發現，0.09%～0.18% 枯草芽孢桿菌組吉富羅非魚幼魚魚血清C3 含量較對照組顯著升高。

3.3 枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物對鯉魚肝臟抗氧化功能的影響 抗氧化指標與動物機體健康程度、體內代謝、外界內氧自由基代脅迫環境的變化和免疫能力均具有密切相關性[3]。T-AOC 可作為抑制脂質過氧化產物形成能力的評價指標；SOD 活性與水生生物的免疫水平密切相關，對增強吞噬細胞防御能力和整個機體的免疫功能具有重要作用；CAT 可清除機體內超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷；DMA 是脂質過氧化物的主要分解產物，可反映細胞受損傷程度及脂質過氧化程度[26]。由于蒲公英提取物中含有綠原酸，可清除體內自由基[9]，而枯草芽孢桿菌作為一種良好的免疫激活劑，可有效增強機體免疫力，提高抗氧化活性[16]。趙倩等[14]采用枯草芽孢桿菌發酵中藥制劑飼喂鯉魚56 d，結果表明，試驗組的T-AOC、SOD、CAT 均不同程度提高，FCR、MDA 含量不同程度降低；沈文英等[27]在飼料中添加枯草芽孢桿菌投喂草魚，其血清T-AOC、SOD 和CAT 活性較對照組均顯著提高，而試驗組血清MDA 含量顯著降低，表明枯草芽孢桿菌對草魚抗氧化能力均有促進作用；本試驗中，枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復合組鯉魚血清 T-AOC、SOD、CAT、GST 及GSH-Px 活性較對照組顯著增加，而MDA 活性顯著下降，表明枯草芽孢桿菌、蒲公英提取物及兩者復合可誘導機體氧化應激增強，飼料中添加枯草芽孢桿菌與蒲公英提取物可發揮協同作用，可為魚類生長性能、免疫功能、抗氧化能力的研究提供理論依據，推測蒲公英提取物可能促進益生菌的增殖，而益生菌可以促進蒲公英提取物的吸收利用。關于芽孢桿菌與蒲公英提取物復合使用的作用機理還有待于進一步研究。

4 結 論

本試驗結果表明，在日糧中添加枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物能明顯促進鯉魚WGR、提高FCR 及改善血液生化指標、增強抗氧化能力并提高其免疫功能，且枯草芽孢桿菌+蒲公英提取物復合使用比單一添加效果更好。由于益生菌與藥食同源植物具有相互協同作用，不僅可以發揮益生菌的優勢，又可提高藥食同源植物的吸收率，因此二者復合作為飼料添加劑具有較好的發展前景。