雙酚A 對豬腎細胞炎性因子表達及凋亡的影響

周 羽，劉 媛，汪序忠，周曉龍，楊松柏，段 星，宋 丹*，李向臣

（1.浙江農林大學動物科技學院動物醫學院，浙江杭州 311300；2.浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室，浙江杭州 311300；3.浙江省安吉振望農牧科技有限公司，浙江湖州 313300）

雙酚A（BPA）是環境內分泌干擾物，也是一種重要的有機化工原料，已大量應用于生活塑料制品制造以及食品金屬包裝表面涂層等。BPA 的大量生產和廣泛應用也使得BPA 在環境中普遍存在。BPA 能夠通過消化道、呼吸道和皮膚吸收進入生物體體內[1]，通過與雌激素受體、雄激素受體、甲狀腺素受體等多種生物受體相互作用，進而干擾生殖系統、內分泌系統、免疫系統、神經系統、代謝功能，以及對后代的生長和發育造成健康危害[2]。已有研究證明BPA 有毒和嚴重的不確定副作用，可能是發展成乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等癌癥的危險因素[3]。研究報道，環境中所含的BPA 能夠降低雄鼠的精子數量、活力，造成精子DNA 損傷[4]。子宮長期暴露于低劑量的BPA（1 μg/kg/day）會引起雌鼠成年時期輸卵管病變[5]，高劑量的BPA（100mg/kg/day）會導致胚胎發育遲緩，發育不全[6]。美國食品和藥物管理局（FDA）確定5 mg/kg BPA 為未觀察到全身毒性副作用的適當水平。已證明，50 mg/kg 的BPA 是造成大鼠腎臟功能中度損傷的最低劑量，并且用于模擬職業工人所暴露的BPA 量[7]。此外，流行病學研究表明，在成年人和兒童尿液中高水平的BPA 與低度蛋白尿風險有關，這也提醒人們注意日常生活中暴露于BPA 可能對腎臟產生不利影響，并可能導致終身累進性腎臟損傷[8]。

目前對于BPA 的研究大部分集中在對動物和人體生殖系統的影響，對腎臟功能的研究較少，特別是對于豬腎臟損傷的研究尚未見報道。因此，本試驗以豬腎細胞（PK15）為試驗材料，檢測BPA 對細胞活力、凋亡、炎性因子表達以及ROS 含量的影響，探討BPA 在豬腎細胞的毒性作用，并揭示其引起腎損傷的可能作用機理，不僅為進一步了解BPA 暴露的毒性作用機理提供科學依據，而且為評估和預防BPA 對豬機體的毒性作用提供參考，進而促進畜牧業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雙酚A：純度＞99.8%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 高糖培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自德國PAN-Biotech 公司；青鏈霉素雙抗購自北京CellMax 細胞技術有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DL2000 Plus DNA Marker 購自南京Vazyme 生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO），多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司；ROS 試劑盒購自美國Sigma 公司；Hoechst33258 細胞凋亡染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司。

1.2 主要儀器 試驗儀器主要包括CO2細胞培養箱、全波長酶標儀、梯度PCR 熱循環儀、熒光定量 PCR 儀（Thermo Electron Corporation）、激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon）、超凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、微量核酸蛋白濃度測定儀（杭州奧盛儀器有限公司）、臺式高速離心機（香港力康發展有限公司）、倒置相差顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）。

1.3 細胞培養 PK15 細胞在補充有10% 胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養基，37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。當細胞長滿時，將細胞培養于6 孔細胞培養板中，根據試驗設計進行BPA處理。

1.4 細胞活力測定 細胞約以 1×105個/mL 濃度接入96孔板，待細胞融合度達到70%～80%，設置不同濃度的BPA (0、1、10、100、200、500 和1 000 μmol/L) 處理，然后設置不同時間梯度（0、2、4、6 h）處理，加入CCK-8 試劑孵育2 h，使用酶標儀讀取450 nm 吸光度，以測定細胞活力并確定最適BPA 處理濃度和處理時間。

1.5 RNA 的提取、引物鑒定和qRT-PCR 分析 使用Trizol 試劑提取PK15 細胞中總RNA，使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為 cDNA。以所得cDNA為模板，利用內參基因GAPDH 作為對照，進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA 質量。使用10×EasyTaqPCR SuperMix 進行 PCR 反應，瓊脂糖凝膠電泳驗證炎性和凋亡相關基因的引物擴增條帶大小和特異性。所有引物退火溫度均調整為61℃，PCR 擴增條件為 95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，61 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，40 個循環；72℃ 5 min。根據TaKaRa 反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說明書混合反應體系，在熒光定量PCR 儀上進行基因表達分析。各基因引物序列見表1。

表1 定量引物序列

1.6 ROS 染色檢測 以2'，7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）來評估ROS 含量。DCFH-DA 是一種細胞通透性非熒光探針，它在細胞內去酯化，被ROS氧化后轉化為高度熒光的2'，7'-二氯熒光素。PK15 細胞置于六孔板內培養，200 μmol/L 的BPA 處理6 h，10 μmol/L DCFH-DA 37℃暗箱孵育30 min，孵育后用PBS 反復清洗去除多余的染色液即可置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 Hoechst33258 染色 細胞以 1×105個/mL 濃度接入放有細胞爬片的6 孔板。當細胞融合度達到70%～80%時，用200 μmol/L BPA 處理試驗組6 h，對照組不做處理。處理后，用4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min，去除固定液，PBS 反復清洗后加入0.5 mL Hoechst 染色液，染色5 min。去除染色液，PBS 反復清洗，加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統計分析 試驗數據以均數±標準誤表示。根據具體試驗，數據分析采用單因素方差（ANOVA）分析不同組間差異或學生t檢驗分析兩組之間的差異。使用Graphpad Prism 軟件繪制圖表。P＜0.05 代表差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 BPA 對PK15 細胞活力的影響 用不同濃度的BPA處理PK15 細胞，CCK-8 檢測細胞活力如圖1-A 所示，隨著BPA 濃度的增加，細胞活力呈劑量依賴性降低。與對照組相比，當BPA 濃度大于等于200 μmol/L 時，PK15 細胞的活力下降（P＜0.001）。然后設置不同的時間梯度），選用200 μmol/L BPA 處理PK15 細胞，結果如圖1-B 所示，隨著處理時間的延長，細胞活力越低，且在處理6 h 時降低（P＜0.001）。

圖1 BPA 對PK15 細胞活力的影響

2.2 RNA 的提取及cDNA 的制備 使用Trizol 溶液提取PK15 細胞總RNA，利用微量核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發現28S，18S 和5S 條帶均較清晰，且28S 最亮，5S 最淺（圖2-A）。隨后，將總RNA 反轉錄成cDNA，以獲得的cDNA 為模板利用內參基因GAPDH進行PCR 擴增，結果顯示擴增條帶單一，且大小符合預期（圖2-B）。

圖2 RNA 和cDNA 的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 普通PCR 驗證引物特異性 如圖3 所示，炎性相關因子基因的引物擴增條帶中總有一條大小符合預期，且條帶清晰而單一（圖3-A），凋亡相關基因的引物擴增條帶也符合預期（圖3-B）。

圖3 引物驗證的瓊脂糖凝膠電泳

2.4 BPA 對PK15 細胞中炎性相關基因表達的影響 如圖4 所示，與對照組相比，200 μmol/L BPA 處理PK15細胞6 h 后，炎性因子相關基因IL-8、IL-6、TNF-αmRNA 相對表達量升高（P＜0.05），IL-1βmRNA 呈現上升趨勢（P＞0.05）。

圖4 BPA 對PK15 細胞中炎性相關基因表達的影響

2.5 BPA 對PK15 細胞凋亡的影響 如圖5-A 所示，與對照組相比，BPA 處理后促凋亡基因Caspase3和BAXmRNA 相對表達量增加（P＜0.01），抗凋亡基因BCL-2mRNA 相對表達量下降（P＜0.01）。免疫熒光染色結果顯示，對照組中沒有明顯凋亡細胞，染色均勻，細胞呈現弱淡藍色熒光；而BPA 處理組中見具有凋亡特征的細胞，細胞核凝結，且呈現強藍色熒光（圖5-B）。

圖5 BPA 對PK15 細胞凋亡的影響

2.6 BPA 對PK15 細胞中ROS 水平的影響 如圖6 所示，與對照組相比，BPA 處理組的ROS 熒光強度增強（P＜0.001）。

圖6 BPA 對PK15 細胞中ROS 水平的影響

3 討 論

BPA 是公認的環境污染物，對人和動物機體的生殖系統、胚胎發育、神經系統、免疫系統等多方面均具有不利影響，對肝、腎、脾和肺等器官有嚴重的毒性作用，如BPA 誘導人體肝臟脂質積累，促進非酒精性脂肪肝的發展[9]。低劑量BPA（0.1 μg/mL）能夠加重小鼠肺炎癥反應，導致免疫功能異常[10]；高劑量BPA（400 mg/kg）大鼠脾臟組織中淋巴濾泡顯著減小，紅髓面積增大，白髓面積減小[11]。腎臟是動物機體重要的器官，維持整個機體的穩態，其功能單位腎元通過三層結構的毛細血管壁，由腎小球濾過將血液和尿液中的雜質和有害物質排出體外，并通過重吸收以維持體液的體積和含量。所以一旦腎臟出現問題，機體內的有毒物質排不出去，有很大安全隱患。本試驗結果表明，高濃度的BPA 能夠顯著降低PK15 細胞活力，增加凋亡的細胞數，促進炎性相關因子的表達以及增加細胞內ROS 含量。這是關于BPA 對豬腎細胞損傷的首次報道，本研究提供了BPA 通過抑制細胞活力，增加細胞凋亡以及炎性反應來損害豬腎臟細胞的證據。

Wang 等[12]研究指出，人類尿中BPA 的最低濃度高達5.56 μg/L，相當于24.35 nmol/L ；Jiao 等[13]選用0.4 mmol/L BPA 作用于大鼠小腸上皮細胞6 h 來模擬急性損傷。考慮到高水平BPA 可能對腎臟細胞產生的影響，本研究分別設置不同濃度和時間梯度的BPA 處理，通過CCK-8 檢測細胞活力發現，BPA 濃度越高，處理時間越長，細胞活力則越低，這與BPA 暴露對小鼠腔前卵泡顆粒細胞、神經干細胞、結腸上皮細胞和小腸上皮細胞的研究結果一致[13-14]，即當BPA 暴露濃度超過100 μmol/L 時，細胞活力和增殖率顯著降低。因此本研究選用200 μmol/L BPA，處理6 h 用于后續試驗。

在畜牧業生產中，飼養管理不當、病理因素和環境因素都有可能損傷體內抗氧化防御系統，誘導氧化應激。在正常條件下，生物體內ROS 的產生和清除維持著一種動態平衡，這種平衡在不利條件下會受到干擾。過量的ROS 會干擾生物體內氧化還原狀態，引起氧化應激發生。研究表明，100 μmol/L BPA 暴露增加了胚泡內ROS 含量，導致線粒體損傷，對豬胚胎發育具有不良影響[15]。BPA 可促進豬卵母細胞產生較高的ROS，抑制卵母細胞的減數分裂成熟，卵丘細胞擴張和功能障礙，以及卵母細胞凋亡[16]。本研究結果表明，BPA 顯著增強了ROS 染色熒光強度，即增加了ROS 產生，能夠誘導豬腎細胞發生氧化應激。

腎臟疾病的病理類型多樣，多種慢性腎臟疾病的發生與發展均與氧化應激有關，因此炎癥調節是腎臟疾病治療發展的關鍵之一[17]。ROS 升高被認為是炎性反應的標志，其通過誘導多種炎性介質和促炎細胞因子的分泌來啟動炎性反應[18]。TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-1β是最常見的炎癥檢測標志物。IL-6 是一種促炎細胞因子，具有支持機體多種慢性炎性反應、誘導急性期反應等功能。IL-6 刺激NK-κB 配體受體活化因子會導致骨吸收和骨質疏松，誘導血管內皮生長因子產生，導致血管生成和血管通透性增加，出現炎癥病變[19]。TNF-α是一種參與機體全身性炎癥反應的細胞信號蛋白，是炎癥反應的關鍵調節劑[20]；IL-8 也是一種有效的促炎趨化因子，IL-8 和TNF-α水平的升高與各種疾病的成年患者的急性腎損傷有關[21]。BPA 暴露可干擾免疫功能，結合PK15 細胞中一些關鍵促炎因子IL-6、IL-8、TNF-αmRNA 相對表達量顯著上調，推斷BPA 可能通過細胞內ROS 積累增加而誘導PK15 細胞發生炎性反應。

有證據表明，ROS 含量增加可能作為第二信使上調促凋亡基因的表達，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase），誘導細胞凋亡[22]。線粒體外膜上的BAX 和BCL-2 二聚體的形成，引起線粒體外膜通透性的改變[23]。當線粒體受損時，Caspase 激活并參與隨后的水解反應，導致細胞凋亡。而且炎癥過度可能誤導細胞激活線粒體凋亡通路，導致細胞凋亡[24]。Yuan 等[25]使 用1、10、100、1 000 μmol/L 的BPA 處理恒河猴胚胎腎上皮細胞，發現BPA 引起ROS 水平上升，誘發氧化應激，進而參與細胞凋亡。一致地，本研究結果顯示，BPA 處理的細胞中促凋亡基因Caspase3和BAX表達顯著增加，抗凋亡基因BCL-2表達顯著降低。Hoechest33258 染色顯示BPA 顯著增加了凋亡細胞數量，充分證實BPA 可誘導細胞凋亡。綜上表明，BPA 誘導的PK15 細胞炎性因子表達上升以及細胞凋亡可能與ROS 含量上升導致的氧化應激增強有著密不可分的關系。

4 結 論

本試驗結果表明，高濃度的BPA（200 μmol/L）顯著降低PK15 豬腎細胞活力，并且呈現一定濃度和時間依賴性，增加細胞內ROS 含量，誘導細胞凋亡和炎性反應。