鎘誘導大鼠肝臟氧化損傷模型的建立

高溫婷，王金榮*，唐桂芬，蘇蘭利，喬漢楨，張亞坤，李林儒

（1.河南工業大學生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南牧業經濟學院動物科技學院，河南鄭州 450011）

氧化應激是指動物機體在遭受各種有害刺激時，體內的氧化和抗氧化系統失衡，體內產生過量的高活性分子如活性氧（ROS）和活性氮（RNS），導致細胞和組織的氧化性損傷[1]。在現代化養殖生產中，飼養環境、飼喂方式、飼糧構成等都會導致畜禽機體氧化應激。由氧化應激引起的氧化損傷可直接導致畜禽機體免疫力低下、慢性炎癥等疾病，降低生產性能，影響畜產品品質[2]。肝臟作為畜禽體內的主要代謝器官，且肝細胞內多達上千個線粒體，極易受到 ROS 攻擊和產生氧化應激[3]。因此，建立肝臟氧化損傷模型對揭示動物氧化應激發生及預防的機制具有重要意義，為開發新型抗氧化功能性飼料，預防肝臟氧化損傷奠定基礎。

鎘是自然界中廣泛存在的有毒重金屬，其半衰期長，不易降解，國際癌癥研究機構（IARC）在1993 年將其列為I 級致癌物[4]。鎘對人和動物的幾乎所有器官產生毒性，急性或慢性接觸鎘會導致肝、腎功能衰竭，骨骼壞死、睪丸萎縮等器官病變，甚至引發癌癥和死亡，其中肝臟是鎘主要的蓄積部位和靶器官[5]。鎘能誘導ROS 產生以及降低抗氧化酶清除自由基的能力，導致組織氧化性損傷[6]。基于此，可以采用鎘損傷方式建立動物氧化應激模型以用于動物抗氧化研究。Nemmiche 等[7]利用2 mg/kg 氯化鎘（CdCl2）溶液皮下注射Wistar 大鼠10 d，發現肝臟指數顯著上升，肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性顯著下降，脂質過氧化產物丙二醛（MDA）水平顯著上升。Bhattacharjee 等[8]采用3 mg/kg 的CdCl2溶液皮下注射Wistar 大鼠7 d，大鼠心臟組織形態改變，MDA 含量顯著增加，出現氧化損傷。李曄等[9]用5 mg/kg CdCl2溶液連續腹腔注射5 d，大鼠體增重和胸腺指數顯著下降，肝細胞部分腫脹、炎癥細胞浸潤。趙英政等[10]利用0.8 mg/kg CdCl2連續腹腔注射7 d 成功建立SD 大鼠肝臟氧化損傷模型。目前采用CdCl2構建動物肝臟損傷氧化模型的濃度、給藥時間及損傷指標等方面的研究不盡相同，因此，本研究擬在國內外鎘損傷模型建立研究的基礎上，通過腹腔注射不同濃度的CdCl2溶液，構建大鼠肝臟氧化損傷模型，為揭示氧化應激機制和開發新型抗氧化飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；蛋白定量（BCA）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（生產批號依次為：20191225、20191129、20191128、20191127、20200620、20200618）。

高速冷凍離心機（ST16R）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；正置倒置一體熒光顯微鏡（RVL-100-G）購自美國Echo 公司；多功能酶標儀（Spark10M）購自瑞士帝肯公司。

1.2 試驗動物及飼養管理 試驗用大鼠及日糧均購于河南省實驗動物中心。6～8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠20 只，體重160～180 g（生產許可證號：SCXK（豫）2017-0001）。自由采食和飲水，每天12 h 光照，相對濕度為40%～60%，溫度20～25℃。

1.3 試驗設計 將20 只雄性SD 大鼠適應性飼養7 d 后，隨機分為4 個處理組，即對照組（0.9%的生理鹽水）、1、2 和5 mg/kg BW 的CdCl2溶液組，每個處理5 個重復，每個重復1 只大鼠，單籠飼養。腹腔注射并持續注射1 周，末次注射后禁食24 h 后脫頸處死。

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 體增重和臟器指數 試驗開始時記錄大鼠初始體重，末次注射24 h 后，稱量大鼠終末體重，脫頸處死，剖取肝臟、脾臟、胸腺放入生理鹽水中清洗，用濾紙吸干后稱取各臟器重量，計算臟器指數。

體增重=終末體重（g）-初始體重（g）

臟器指數=（臟器重量/體重）×100%

1.4.2 AST、ALT 活性 鼠摘眼球取血，采集好的血液放入無菌離心管中，使離心管在室溫下呈45°角放置1 h；待血液凝固收縮后，3 500 r/min 離心10 min，取上清待測。AST、ALT 檢測均嚴格按照AST、ALT 的試劑盒說明書操作。

1.4.3 肝組織氧化損傷指標 準確稱取1g 肝臟組織，按照重量（g）:體積（mL）為1:9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，在冰水浴下勻漿組織，然后3500 r/min 離心15 min，取上清液即10% 勻漿上清液待測。BCA、MDA 含量和SOD、GSH-Px 及CAT 活性的檢測均嚴格按照BCA、MDA、SOD、GSH-Px 和CAT 的試劑盒說明書操作。

1.4.4 肝組織形態學觀察 取大鼠右葉肝臟組織，放入10%福爾馬林溶液中浸泡進行固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色,封片后于顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

1.4.5 統計分析 采用SAS 9.0 軟件對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），結果以平均值±標準差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果

2.1 CdCl2對體增重、臟器指數的影響 如表1 所示，腹腔注射CdCl2溶液導致大鼠的體增重降低，隨著注射劑量增加大鼠的體增重降低，1、2 和5 mg/kg BW的CdCl2試驗組的大鼠體增重比對照組分別下降7.21%（P＞0.05）、12.23%（P＜0.05）和41.81%（P＜0.05）。與對照組相比，1、2 和5 mg/kg BW 的CdCl2試驗組的肝臟指數分別提高了0.23%（P＞0.05）、15.98%（P＜0.05）、20.54%（P＜0.05），2 和5 mg/kg CdCl2組的肝臟指數高于對照組和1 mg/kg CdCl2組（P＜0.05）。5 mg/kg CdCl2組的胸腺指數較對照組下降53.84%（P＜0.05）。1、2、5 mg/kg CdCl2組的脾臟指數較對照組分別下降了3.03%、6.06%、9.09%，其中，5 mg/kg CdCl2組低于其余各組（P＜0.05）。

表1 CdCl2 對體增重、臟器指數的影響

2.2 CdCl2對大鼠血清AST、ALT 活性的影響 由表2 可知，腹腔注射CdCl2溶液導致大鼠血清的AST 和ALT 活性升高，1、2、5 mg/kg CdCl2組AST 活性分別較對照組升高11.84%（P＞0.05）、48.34%（P＜0.05）、82.45%（P＜0.05），且5 mg/kg CdCl2組顯著高于1mg/kg CdCl2組。1、2、5 mg/kg CdCl2組的ALT 活性較對照組分別升高18.03%（P＞0.05）、45.33%（P＜0.05）、65.23%（P＜0.05），其中2、5 mg/kg CdCl2組顯著高于1 mg/kg CdCl2組。

表2 大鼠血清中AST 和ALT 活性

2.3 CdCl2對大鼠肝組織MDA 和SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 由表3 可知，與對照組相比，1、2、5 mg/kg CdCl2組MDA 含量分別提高了7.33%（P＞0.05）、17.33%（P＜0.05）、52.00%（P＜0.05），5 mg/kg CdCl2組顯著高于其余各組。1、2、5 mg/kg CdCl2大鼠肝臟SOD 活性較對照組分別降低了2.38%（P＞0.05）、11.38%（P＜0.05）、15.32%（P＜0.05），其中2 和5mg/kg CdCl2組均顯著低于對照組和1mg/kg CdCl2組。1、2、5 mg/kg CdCl2組GSHPx 活性較對照組分別降低了9.15%（P＞0.05）、18.63%（P＜0.05）、28.47%（P＜0.05），5 mg/kg CdCl2組顯著低于其余各組。試驗組CAT 活性差異均不顯著。

表3 肝組織MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性

2.4 肝臟的組織形態學觀察 圖1 為肝臟組織的形態學觀察結果。對照組肝臟組織形態結構完整，肝細胞索排列整齊呈放射狀，肝細胞無壞死現象（圖1-A）。1 mg/kg CdCl2組肝細胞形態結構無明顯異樣，肝細胞索排列較整齊（圖1-B）。2 mg/kg CdCl2組肝組織形態結構異常，部分肝細胞濁腫，細胞核濃縮或溶解，肝細胞局部壞死以及炎癥細胞浸潤（圖1-C）。5 mg/kg CdCl2組肝細胞結構破壞極其嚴重，細胞核大量濃縮或溶解，肝細胞大面積壞死，有大量炎癥細胞浸潤（圖1-D）。

圖1 大鼠肝臟組織形態（HE 染色，×200 觀察）

3 討 論

3.1 CdCl2對體增重、臟器指數的影響 鎘對胃腸黏膜和胰腺具有直接的損傷作用，會造成胃腸黏膜脫落、淺表性壞死和抑制胰腺的分泌功能，影響腸道對營養物質的消化、吸收和利用，進而導致體重下降[11]。徐光翠等[12]研究發現，連續7 d 對大鼠進行腹腔注射1 mg/kg CdCl2，大鼠的體增重明顯低于對照組。本試驗中，腹腔注射1 mg/kg CdCl2的大鼠體增重與對照組沒有顯著差異，但注射2 和5 mg/kg CdCl2組的大鼠體增重則顯著低于對照組和1 mg/kg CdCl2組，這可能是由于鎘對大鼠的胃腸道造成損傷引起食欲下降，導致營養物質消化吸收受阻所致。

肝臟是機體的主要解毒器官，胸腺和脾臟是機體的主要免疫器官。臟器指數增加說明臟器充血、腫大，臟器指數減小則表明臟器萎縮、壞死等[13]。本試驗結果顯示，2 和5 mg/kg CdCl2組的肝臟指數顯著高于對照組，這與汪紀倉等[14]的研究結果一致，分析認為可能是由于鎘在肝臟內的大量蓄積引起肝臟充血、腫大導致的肝臟指數增加。免疫器官指數可反應免疫器官的發育水平和機體的免疫功能狀態，在本研究條件下，胸腺、脾臟指數和鎘的處理劑量呈負相關，在5 mg/kg CdCl2劑量時與對照組相比達到顯著水平，說明鎘對胸腺、脾臟產生了毒性并抑制了免疫器官的生長發育，且5 mg/kg CdCl2組的免疫功能受損最為嚴重，劉永琦等[15]也有相似報道。

3.2 CdCl2對大鼠血清AST、ALT 活性的影響 AST 和ALT 是檢測肝功能最敏感的指標。正常生理狀態下，AST 和ALT 主要存在于肝組織的細胞內，當肝臟受損時，肝細胞結構被破壞，細胞膜通透性增加，AST 和ALT 釋放到血液中，血液中AST 和ALT 活力就會增加，血清中AST 和ALT 的活力與肝受損程度呈正相關[16]。有研究發現，鎘中毒的小鼠血清中AST、ALT 活力是正常小鼠的2～4 倍，證明了鎘對肝臟有很強的毒性作用[17]。本研究結果顯示，試驗組血清中AST 和ALT 活力與對照組相比不斷升高，其中2 和5 mg/kg CdCl2組呈顯著趨勢，提示鎘對大鼠肝臟造成損傷，且損傷程度與鎘劑量呈量效關系。

3.3 CdCl2對大鼠肝組織MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 MDA 是膜脂質過氧化的終產物，其水平一定程度上反應氧化應激損傷程度[18]。SOD、GSH-Px、CAT 是胞內第一道抗氧化酶防御系統，SOD是一種抗氧化金屬酶，其能夠催化超氧陰離子自由基轉變成H2O2和O2，而H2O2比超氧陰離子具有更強的毒性，隨后H2O2又在CAT 和GSH-Px 的作用下分解為H2O 和O2，因此該系統在清除自由基和緩解細胞遭受氧化應激損傷方面發揮著重要作用[19]。傅晗等[20]研究發現，給予SD 大鼠灌胃0.8 mg/ml CdCl2溶液20 d，鎘處理組肝組織中MDA 水平顯著高于對照組，SOD、GSH-Px 和CAT 活性顯著低于對照組。Fang 等[21]采用5 mg/kg CdCl2溶液對SD 大鼠連續灌胃28 d，發現鎘組大鼠肝組織中MDA 和ROS 水平較對照組顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著下降。本研究中鎘處理組大鼠肝臟MDA 含量增加，并且在2 和5 mg/kg CdCl2處理組中達到顯著水平，且5 mg/kg CdCl2組顯著高于2 mg/kg CdCl2組。但SOD、GSH-Px 和CAT 的活性與MDA 的水平呈現相反的趨勢，隨著鎘處理劑量的增加，SOD、GSH-Px 和CAT 的活性降低，并在2和5 mg/kg CdCl2的處理組中達到顯著水平。分析認為鎘可降低肝臟的抗氧化水平導致氧化損傷，并且鎘誘導的肝臟氧化損傷具有劑量依賴性。

3.4 CdCl2對大鼠肝臟組織形態的影響 肝組織結構的破壞是肝臟受損最直觀的病理表現，本試驗中肝組織HE 染色結果進一步證明了腹腔注射2 和5 mg/kg CdCl2可導致組肝組織形態結構紊亂，肝細胞濁腫、沖血，炎癥細胞浸潤。5 mg/kg CdCl2組肝細胞普遍濁腫，細胞核大量壞死，炎癥細胞浸潤加重，證明5 mg/kg CdCl2已經對大鼠肝臟造成不可逆損傷，這與本試驗中血清AST 和ALT 活力升高的結果一致，也間接驗證了肝臟腫大導致肝臟指數升高，此外肝臟中MDA 水平的升高和SOD、GSH-Px 活性的下降也預示了肝臟發生氧化損傷。

4 結 論

在本試驗條件下，采用2 mg/kg BW 的CdCl2對大鼠連續腹腔注射7 d 顯著降低了大鼠的體增重和肝組織SOD、GSH-Px 活性，肝臟指數、肝組織MDA 含量和血清中AST、ALT 水平顯著提高，出現肝組織的形態結構破壞，引發炎癥細胞浸潤等病理損傷，符合肝臟氧化損傷模型的建立標準，表明成功建立了大鼠肝臟氧化損傷模型。