運輸應激對山羊小腸形態和熱休克蛋白表達的影響

鄭文亞，李國生，劉 犇,2,3*，方滿新,2，胡迎東,2，胡 威,2，彭瑞妮,2,3，高 凡

（1.宜春學院生命科學與資源環境學院，江西宜春 336000；2.江西綠科農牧科技有限公司，江西宜春 336000；3.江西省高等學校硒農業工程技術研究中心，江西宜春 336000）

現代動物生產中，養殖場與市場、屠宰場之間的畜禽安全運輸是十分重要的一個環節[1]。然而在運輸過程中，各種不良因素會導致動物的壓力增加，如陌生環境、禁食缺水、通風不良、高溫或低溫、動物的裝卸、噪聲以及車廂環境的污染均會危害動物福利[2]，增加發病率和死亡率[3]。而小腸作為消化、吸收和營養物質代謝的重要場所[4]，極易成為熱應激、運輸應激和缺氧應激等不良反應的靶器官[5]，某些消化系統疾病通常是由這些反應引起的，例如食欲不振或亢進、腹瀉或便秘等，嚴重時可能導致動物死亡。研究表明，運輸應激損害大鼠小腸并破壞某些重要基因的表達[6]。

熱休克蛋白（HSPs）作為主要的應激相關蛋白，由于其在細胞中的生理和保護作用通常被稱為分子伴侶[7]。當細胞處于應激狀態時，HSPs 水平升高，促進蛋白質的正確折疊，維持蛋白質的天然結構和功能[8]。對于某些由應激引起的胃腸道疾病，如胃潰瘍等，HSPs 可能起重要的保護作用[9]。此外，HSPs 家族中不同成員在正常和應激條件下表現出不同的功能[10]。其中，HSP90在細胞適應應激，維持正常細胞功能中起重要作用[11]，HSP70 家族被認為是細胞內有效的應激緩沖體系[12]，而HSP27 在細胞發育、免疫功能調節和疾病防治中均發揮重要作用[13]。本研究旨在探討運輸應激對山羊小腸顯微和超微結構的損傷及其對熱休克蛋白表達的影響，對于臨床上緩解運輸應激所帶來的危害有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇木精、伊紅染液購自北京夢怡美生物科技有限公司，小鼠SP 免疫組化試劑盒及濃縮二氨基聯苯胺（DAB）顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司，HSP27（ab79868）、HSP70（ab5439）、HSP90（ab13492）以及山羊抗小鼠IgG（ab6789）購自abcam 公司，小鼠抗β-actin 內參蛋白（BM0627）和免疫印跡技術彩色預染蛋白Marker（AR1113）購自博士德生物，4× 蛋白上樣緩沖液（AI11800A）購自TAKARA 公司，超敏化學發光檢測試劑盒（GS0720）購自US EVERBRIGHT INC 公司。

1.2 實驗動物處理 隨機選擇體重（13.89±2.96 kg）、體況相似的12 只健康贛西公山羊，分為3 組，分別為對照組（不運輸）、運輸應激2 h 組、運輸應激6 h 組，每組4 只，溫度28～32℃（實驗時間為2018 年7 月28日），禁食、禁水以35～45 km/h 的速度進行公路運輸。頸部快速放血致死后迅速采取山羊十二指腸、空腸和回腸，部分放入4% 多聚甲醛和2.5% 戊二醛中固定，部分放入液氮中速凍后轉入-80℃超低溫冰箱保存，用于后續實驗。

1.3 病理學研究 將4%多聚甲醛溶液固定48 h 以上的十二指腸、空腸及回腸組織，流水沖洗24 h 以上，后經脫水、透明、浸蠟、包埋制成組織切片，進行HE 染色后于光學顯微鏡下進行拍照，觀察其病理變化。將2.5%戊二醛固定液中固定72 h 的十二指腸、空腸及回腸組織置于1%的鋨酸中固定，常規脫水、包埋后用超薄切片機進行切片，經醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察并進行拍攝。

1.4 免疫組織化學 將制備好的小腸組織石蠟切片進行烘片、脫蠟、微波抗原修復后，依據小鼠SP 免疫組織化學試劑盒操作要求進行操作，HSP27、HSP70、HSP90 均按1:400 稀釋，設置陰性對照（一抗用PBS代替）。DAB 顯色后蘇木精復染，鹽酸酒精分化，返藍后脫水、透明、封片，立即進行觀察和拍照，出現黃色或棕色即為陽性表達。

1.5 免疫印跡技術 取小腸組織充分研磨碾碎、加入裂解液裂解后用組織細胞總蛋白抽提試劑盒按操作步驟提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，并將實驗組和對照組的總蛋白濃度調為一致。將制備好的蛋白液上樣后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，PVDF 膜濕轉50 min，TBST 洗滌后封閉2 h，將膜裁剪成適宜大小后用TBST洗滌3 次，10min/ 次；4℃條件下放入一抗（HSP27、HSP70、HSP90 分別按1:5000、1:1000、1:1000 稀釋）與小鼠抗β-actin（1:1000 稀釋）孵育18 h，TBST 洗滌3 次，10min/次；室溫下孵育山羊抗小鼠IgG（HSP27、HSP70、HSP90 分別以1:8000、1:20000、1:2000 稀釋）、內參蛋白（1:1000 稀釋）2h，TBST 洗滌3 次，10min/次。最后將PVDF 膜按照HRP-ECL 化學發光試劑盒的說明進行成像，AI600 化學發光成像儀拍照。用Image Pro Plus 6.0 軟件對采集的條帶圖像進行密度值分析，目的蛋白與相對應的內參蛋白條帶的密度值比值記為測試值。

1.6 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR 在之前報道方法[14]的基礎上進行了改進。使用組織RNA 試劑盒（R6812，Omega，USA）分離總RNA，并使用第一鏈cDNA 合成的逆轉錄反應預混液試劑盒（AT301，TransGen,China）逆轉錄為cDNA。使用Top Green qPCR SuperMix 試劑盒（AQ131，TransGen）在CFX96 TouchTM實時系統（Bio-Rad,USA）上擴增cDNA，表1 列出了所使用的引物序列。通過2-ΔΔCt方法分析實時熒光定量PCR 的數據，將相對表達水平標準化為β-肌動蛋白的表達水平。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.7 統計分析 使用SPSS 18.0 軟件進行數據分析，單因素方差分析后再進行LSD 多重比較。數據表示為平均值±標準差，P＜0.05 表示有顯著差異，P≥0.05 表示無顯著差異。

2 結果

2.1 運輸應激山羊小腸的顯微病理學觀察 如圖1 所示，與對照組相比，運輸應激后小腸組織結構均有損傷，主要發生在固有層，固有層炎性細胞浸潤十分明顯，十二指腸和空腸多為淋巴細胞和漿細胞浸潤，回腸主要為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤，此外，固有層充血出血，腺上皮破損、變性。十二指腸和空腸固有層細胞變性壞死，中央乳糜管擴張，部分管腔中可見壞死脫落的細胞碎屑（圖1-B1），炎性細胞浸潤明顯（圖1-C1），毛細血管充血出血（圖1-B2），腸上皮細胞發生壞死、融合（圖1-C2）。少量回腸黏膜上皮細胞變性壞死，固有層炎性細胞浸潤（圖1-B3、1-C3），腺體結構不完整，嚴重者腺體結構崩解，腺上皮細胞變性壞死，胞核碎裂溶解，胞質淡染出現空泡化，毛細血管充血出血（圖1-B3）。

圖1 山羊小腸顯微病理學觀察（HE 染色，400×）

2.2 運輸應激山羊小腸的超微病理學觀察 透射電鏡觀察發現，運輸應激組十二指腸柱狀上皮細胞微絨毛彎曲、倒伏，線粒體增生、腫脹和空泡化，內質網結構不完整、膜破裂，細胞核固縮、核膜內陷，染色質凝集邊移，電子密度增高（圖2 A1-C1）。空腸上皮細胞微絨毛也發生彎曲、倒伏，大量高電子密度的神經內分泌顆粒出現在細胞頂部，線粒體增殖聚集，呈圓形、細長型或S 形，部分出現腫脹、嵴斷裂、內部結構模糊等現象，細胞核異常，有不同程度的固縮、壞死和凋亡，電子密度高（圖2 A2-C2）。回腸柱狀上皮細胞微絨毛彎曲、倒伏，部分核濃縮、形狀不規則，核膜內陷或破裂，異染色質凝集邊移，胞質中可見較多囊泡和小管，糖原豐富，線粒體增生，集中在微絨毛下方，形態各異，部分線粒體腫脹、嵴消失、內部結構模糊（圖2 A3-C3）。

圖2 山羊小腸超微病理學觀察（醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色）

2.3 山羊小腸三種熱休克蛋白的表達定位 HSP27 在十二指腸腸絨毛黏膜上皮細胞表達，且主要在胞質中表達，呈黃色，固有層白細胞有少量表達，在腸腺周圍組織中表達較多，呈黃色或淺黃色（圖3-A1、B1、C1）；HSP70 在十二指腸主要表達于絨毛黏膜上皮細胞胞漿中，呈黃色，在固有層有少量白細胞表達，呈黃色或棕黃色，其他部位則無表達（圖3-D1、E1、F1）；HSP90 在十二指腸的表達主要出現在腸絨毛黏膜上皮細胞胞核及胞質中，呈淺黃色（圖3-G1、H1、I1）。空腸HSP27 主要表達部位在腸絨毛黏膜上皮細胞胞質，而基底部、小腸腺周圍組織表達較少（圖3-A2、B2、C2）；空腸HSP70 主要在腸絨毛黏膜上皮細胞胞質中表達，在固有層僅腸絨毛處有少量白細胞表達，其他部位則無表達（圖3-D2、E2、F2）；HSP90 在腸絨毛上皮及小腸腺上皮細胞表達，表達主要在細胞核，呈棕色或淺棕色（圖3-G2、H2、I2）。HSP27 在回腸腸絨毛黏膜上皮細胞胞質有表達，呈深棕色或棕色，固有層結締組織、壞死脫落的細胞碎屑以及白細胞均有表達，呈棕黃色，小腸腺上皮也有表達，呈淺黃色，小腸腺周圍白細胞及結締組織表達呈棕黃色（圖3-A3、B3、C3）；HSP70 在回腸表達量少，僅在腸絨毛黏膜上皮細胞胞質有表達，呈黃色或淺黃色（圖3 D3、E3、F3）；HSP90 在回腸主要在腸絨毛黏膜上皮細胞胞核表達，呈棕色或棕黃色，在小腸腺上皮也表達，呈棕色或淺棕色，在集合淋巴小結中，大量淋巴細胞表達，胞核呈棕色（圖3G3、H3、I3）。

圖3 山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 蛋白的表達情況（400×）

2.4 山羊小腸熱休克蛋白mRNA 和蛋白的定量表達情況與對照組相比，運輸應激后山羊十二指腸中HSP27 的mRNA 水平在2、6 h 運輸應激組均上調（P＜0.05），HSP70 僅在6 h 運輸應激組上調（P＜0.05），而HSP90 mRNA 水平無顯著變化（圖4-A），運輸應激后HSP27、HSP70 蛋白表達水平無變化，而6 h 運輸應激組HSP90 蛋白表達水平增加（P＜0.05，圖4-B、C）。與對照組相比，運輸2 h 組山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調（P＜0.05），運輸2 h 組和6 h 組HSP70 mRNA水平均增加（P＜0.05，圖4-D），但3 種蛋白的表達量均沒有變化（P＞0.05，圖4-E、F）。與對照組回腸相比，HSP27 mRNA 和蛋白水平在2 h 組均下調（P＜0.05），HSP70 mRNA 和蛋白水平在2 h 組增加（P＜0.05），HSP90 mRNA 和蛋白水平在2 h、6 h 運輸應激后均無變化（圖4-G、H、I）。

圖4 運輸應激對山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 mRNA 和蛋白水平的影響

3 討 論

運輸常導致動物體重下降、免疫力降低和肉品質下降[15-16]，還會破壞反芻動物瘤胃生態系統的穩定，使菌群發生變化、釋放內毒素、對病原微生物的抵抗能力減弱，從而增加消化道感染的風險[15,17]。腸道具有營養吸收和屏障2 個重要功能[2]，尤其是腸道屏障功能的完整性對機體健康十分重要[18-19]，腸道屏障功能受損后極易引起各種胃腸道及胃腸道之外的疾病，包括肝病、代謝綜合征與肥胖癥等[20-22]。有研究報道大鼠空腸在運輸后出現損傷，可能與細胞凋亡、氧化應激及激素失衡有關[6]；此外，熱應激時豬腸道也會出現明顯損傷，包括腸絨毛頂端受損、上皮細胞脫落、腸黏膜固有層暴露、絨毛高度和隱窩深度降低等[23-24]。本研究發現運輸后小腸絨毛結構不完整，細胞壞死脫落，出現較多的炎性細胞浸潤及充血出血現象，腸上皮細胞微絨毛倒伏彎曲，胞核固縮，線粒體腫脹、嵴斷裂，以上結果表明運輸應激對山羊小腸造成了一定的結構損傷，將會致使腸道通透性增加、細菌發生易位，影響其吸收和屏障功能，從而造成運輸后腹瀉等疾病發生率升高[25]。

HSPs 能夠作為分子伴侶參與蛋白質的折疊、轉運和分配，在各種不良環境條件下，HSPs 可從細胞中釋放，維持細胞內環境的穩態，并可激活多種調控蛋白，阻斷細胞凋亡[26]。不同家族的HSPs 在正常或應激條件下其功能也不一樣，其中HSP90 對細胞發揮正常功能以及對應激的適應起著重要作用，HSP90 作為分子伴侶，可以保護蛋白質免受降解，并能與多種信號分子形成復合物，以維持細胞的生長和生存[27]，HSP90 在體外保護小腸上皮細胞免受過氧化氫或吲哚乙酸誘導的細胞損傷方面發揮重要作用，通過調控HSP90 過表達可提高對小腸上皮細胞的保護作用[28]。另有研究發現在豬運輸應激過程中，由于胃及心臟中HSP90 水平都顯著下降，造成其消化道和心臟出現損傷[27,29]。本研究發現運輸6 h 后山羊十二指腸HSP90 蛋白表達水平升高，運輸2 h 后山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調，HSP90 的上調可能與緩解運輸應激造成的腸道損傷有關。

HSP70 能增強細胞對環境變化和致病條件的耐受性，提高細胞存活率[4]。在大鼠早期腸黏膜燙傷模型中，HSP90 和HSP70 總含量顯著升高，從而保護腸黏膜細胞和黏膜屏障[30]，可見在HSP90 發揮保護作用的同時，腸道細胞還可通過增加HSP70 的表達來抵抗應激。HSP70 被認為是保護腸上皮細胞免受有害物質侵襲，防治潰瘍的重要物質，其表達可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進蛋白合成，從而加速潰瘍的愈合[4]，另外，HSP70 的表達還能夠調節腸道內消化酶的活性，從而改善腸道消化吸收功能[5]，研究表明HSP70 還可在熱應激誘導下通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活發揮對大鼠小腸損傷的保護作用[31]。本實驗結果顯示運輸6 h 后山羊十二指腸HSP70 mRNA 水平升高，運輸2 h和6 h 后山羊空腸HSP70 mRNA 水平增加，山羊回腸HSP70 mRNA 和蛋白水平在運輸2 h 后明顯增加，提示HSP70 的上調對運輸應激山羊小腸可能起著重要的保護作用。本研究發現運輸應激后山羊十二指腸中HSP27的mRNA 水平在2 h 組、6 h 組均升高，HSP27 作為小分子HSPs 家族的一員，能夠維持細胞骨架與刺激細胞增殖[26,29]，HSP27 主要通過參與細胞死亡途徑（如壞死、凋亡或自噬）來保護細胞免受其他致命條件的傷害[32]，當腸上皮細胞受損時，HSP27 的磷酸化可作為腸上皮細胞反應激活的一種新型信號通路，使腸道能夠快速重建腸上皮黏膜屏障，從而保護腸道的完整性[33]。

總之，運輸應激會對山羊小腸顯微和超微結構造成一定程度的損傷，運輸后三種熱休克蛋白表達量的變化提示其可能對運輸應激山羊小腸起著一定的保護作用。