不同保護劑對馬鹿精液常溫和低溫保存效果的影響

李彥林，庫爾班·吐拉克，金大智，楊 瑋，呂楊茂

（新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052）

人工授精是馬鹿保種及良種推廣應用的重要手段，精液品質會影響馬鹿的受胎率和仔鹿質量，所以精液保存尤為重要。在養鹿生產中，為充分利用優秀公鹿的遺傳作用，需要將其精液保存下來并最大限度地延長精子的存活時間和受精能力。目前，鹿類精液保存多采用冷凍保存法，其人工授精受胎率較低，且多數稀釋液配方成分復雜，使用效果差異較大[1-2]，關于鹿類精液常溫保存及低溫保存方面的研究報道較少。

研究表明，一定濃度的牛血清白蛋白（BSA）可以提高精子的生存能力[3]。另外，稀釋液中添加動物源性蛋白（如卵黃）會提高精子感染風險[4]，選用大豆卵磷脂代替動物源性蛋白[5]可以降低精子感染風險并提高精子的生存能力。人工冬眠可降低機體對各種病理刺激的反應，有研究將冬眠合劑添加到精液低溫保存稀釋液中[6]。馬鹿精液常溫保存稀釋液中添加BSA、大豆卵磷脂等能否延長其存活時間及低溫保存稀釋液中添加卵黃、冬眠合劑等能否延長其存活時間等一系列問題方面尚未見報。基于此，本實驗以新疆伊河馬鹿精液為研究對象，在精液保存稀釋液中添加葡萄糖、蔗糖、BSA、大豆卵磷脂、卵黃及冬眠合劑等，探討不同保護劑對馬鹿精液常溫及低溫保存效果的影響，為提高馬鹿配種效率及人工授精技術在馬鹿養殖業中的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2020 年9—11 月在新疆昌吉盛華馬鹿繁育基地進行，選用4～9 歲成年、健康的伊河馬鹿公鹿15 頭，采用單圈飼養。實驗期間，馬鹿由專人飼喂，精料由玉米、麩皮、棉蛋白、葵粕、棉粕等組成，日喂量為0.5～1 kg，粗飼料由青貯、苜蓿干草和麥秸組成，自由采食，并保證充足潔凈的飲水。

1.2 精液的采集及質量檢測

1.2.1 精液的采集及預處理 馬鹿精液的采集采用麻醉保定電刺激采精法[7]。每次采集3 頭公鹿精液并確保精液顏色和氣味正常，精子活力達到0.8 以上的精液緩慢混勻，并用含有不同保護劑的稀釋液按1 ∶5 的比例稀釋，每隔4 h 檢測精子的活力、頂體完整率、存活時間等。每個試驗重復3 次。

1.2.2.1 精子活力的檢測 用精子分析儀分析5 個視野下精子的活力。精子活力=（直線前進運動的精子/精子總數）×100%。

1.2.2.2 頂體完整率的測定 采用抹片法制作標本，觀察精子頂體完整率。將制作好的抹片用姬姆薩染色液染色，在顯微鏡下放大400 倍觀察精子形態，查數不同視野下100 個精子中所含的頂體完整精子數，計算精子的頂體完整率：頂體完整率=（頂體完整精子數/100）×100%。

1.2.2.3 存活時間的測定 存活時間的計算：精子存活時間是由第1 次檢測精子活力開始計時至倒數第2 次檢測精子活力所經歷的時間，再加上最后1 次至倒數第2次檢測精子活力所需時間的1/2。為此，對于倒數第1次和倒數第2 次精子存活時間的處理是采用折中的方法,以盡可能接近精子實際的存活時間。

1.3 實驗設計

1.3.1 精液保存基礎液的優化 在應用本實驗室優化的馬鹿精液冷凍保存基礎液（由Tris、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖、青鏈霉素等組成）中分別添加0.1%葡萄糖、0.1%蔗糖、0.1%葡萄糖+0.1%蔗糖，探討基礎液中的葡萄糖和蔗糖對馬鹿精液保存的作用并優化基礎液。

1.3.2 常溫保存實驗 在優化的基礎稀釋液中分別添加0、0.1%、0.2%、0.3% BSA，并常溫（20 ℃）保存，篩選BSA 的最適添加濃度，然后在此基礎上分別添加0.1%、0.2%、0.3%大豆卵磷脂，篩選出最優大豆卵磷脂濃度。

1.3.3 低溫保存試驗 經常溫試驗組所篩選出來的稀釋液100 mL 中分別添加5%、10%、15%卵黃和1.25%、2.5%、5% 冬眠合劑，并低溫（4℃）保存，分別篩選卵黃和冬眠合劑的最優試驗組和最優濃度配比并比較兩者的差異性。

1.4 統計分析 使用WPS 2019 軟件對數據進行整理分析，數據的統計顯著性實驗檢驗使用IBM SPSS Statistics 25 軟件中的單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，并采用Duncan's 方法對各組平均數進行多重比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同基礎液對馬鹿精液常溫保存效果的影響 由表1 可知，在常溫（20℃）條件下，各組精子活力隨著保存時間的推移呈逐漸下降趨勢，葡萄糖+蔗糖組的精子活力優于單一含葡萄糖和蔗糖組（P＞0.05），且精子能夠保持60%以上活力的時間不足4 h。另外，馬鹿精液分別在不同基礎液中常溫（20℃）條件下保存，精子存活時間由高到低為葡萄糖+蔗糖組＞蔗糖組＞葡萄糖組（P＞0.05）。

表1 不同基礎液對馬鹿精子活力及存活時間的影響（20℃）

2.2 BSA 對馬鹿精液常溫保存效果的影響

2.2.1 不同濃度BSA 對馬鹿精子活力及存活時間的影響由表2 可知，在常溫（20℃）保存條件下，保存24 h前添加BSA 組各時間點的精子活力均高于0%BSA 組（P＜0.05），且能夠保持60% 以上精子活力的時間均為16 h（P＞0.05）；保存24 h 后0.2 %BSA 組各時間點的精子活力高于其他組（P＜0.05），且能夠保持60%以上精子活力的時間可達24 h。另外，0.2 %BSA 組的精子存活時間最長，為75.33 h,高于其他3 組（P＞0.05）。

表2 不同濃度BSA 對馬鹿精子活力及存活時間的影響（20℃）

2.2.2 不同濃度BSA 對馬鹿精子頂體完整率的影響 由表3 可知，馬鹿精液保存基礎液中添加不同濃度BSA（0、0.1 %、0.2 %、0.3 %）并在常溫（20℃）條件下保存，各組精子頂體完整率隨著保存時間的推移逐漸下降趨勢，其中濃度為0.2 %BSA 組略優于其他組（P＞0.05）。

表3 不同濃度BSA 對馬鹿精子頂體完整率的影響（20℃） %

2.3 大豆卵磷脂對馬鹿精液常溫保存效果的影響

2.3.1 不同濃度大豆卵磷脂對馬鹿精子活力及存活時間的影響 由表4 可知，在常溫（20℃）保存條件下，保存24 h 前0.2 %大豆卵磷脂組在各時間點的精子活力略優于其他組（P＞0.05）；保存36 h 時0.2 %組和、0.3 %大豆卵磷脂組的精子活力高于0.1% 大豆卵磷脂組和對照組（P＜0.05），但0.2% 組和0.3 組無顯著差異；0.2%大豆卵磷脂組保存48 h 時的精子活力高于其他組（P＜0.05），在60～72 h 極顯著高于0.1%大豆卵磷脂組和對照組，且該組能夠保持60% 以上精子活力的時間可達48 h。另外，0.2%、0.3%大豆卵磷脂組的精子存活時間高于其他2 組（P＜0.05），但0.2 %組和0.3 %組無顯著差異。

表4 不同濃度大豆卵磷脂對馬鹿精子活力及存活時間的影響（20℃）

2.3.2 不同濃度大豆卵磷脂對馬鹿精子頂體完整率的影響 由表5 可知，在常溫（20℃）條件下保存，各組精子頂體完整率隨著保存時間的推移逐漸下降趨勢，其中0.2 %大豆卵磷脂組略優于其他組（P＞0.05）。

表5 不同濃度大豆卵磷脂對馬鹿精子頂體完整率的影響（20℃）

2.4 卵黃和冬眠合劑對馬鹿精液低溫保存效果的影響

2.4.1 卵黃和冬眠合劑對馬鹿精子活力及存活時間的影響 由表6 可知，在低溫（4℃）保存條件下，保存8 h前15%卵黃組在各時間點的精子活力高于5%、10%卵黃組（P＜0.05）以及對照組（P＜0.01）；12 h 后15%卵黃組在各時間點的精子活力高于其他組（P＜0.01），且能夠保持60% 以上精子活力的時間可達16 h。15%卵黃組的精子存活時間最長（P＜0.01），為78 h。

表6 不同濃度卵黃對馬鹿精子活力及存活時間的影響（4℃）

由表7 可知，在低溫（4℃）保存條件下，保存16 h前5%冬眠合劑組各時間點的精子活力高于1.25%、2.5%組（P＜0.05）以及對照組（P＜0.01）；20 h 后5%組各時間點的精子活力高于其他組（P＜0.01），且能夠保持60%以上精子活力的時間可達24 h。另外，5%冬眠合劑組的精子存活時間最長（P＜0.01），為84.67 h。

表7 不同濃度冬眠合劑對馬鹿精子活力及存活時間的影響（4℃）

2.4.2 卵黃和冬眠合劑對馬鹿精子頂體完整率的影響由表8 可知，馬鹿精液保存稀釋液中添加不同濃度卵黃（0、5%、10%、15%）并在低溫（4℃）條件下保存，各組精子頂體完整率隨著保存時間的推移逐漸下降趨勢，其中15 %卵黃組略優于其他組（P＞0.05）。

表8 不同濃度卵黃對馬鹿精子頂體完整率的影響（4℃）

由表9 可知，馬鹿精液保存稀釋液中添加不同濃度冬眠合劑（0、1.25 %、2.5%、5%）并在低溫（4℃）條件下保存，各組精子頂體完整率隨著保存時間的推移逐漸下降趨勢，其中5 % 冬眠合劑組略優于其他組（P＞0.05）。

表9 不同濃度冬眠合劑對馬鹿精子頂體完整率的影響（4℃）

3 討 論

3.1 不同基礎液對馬鹿精液常溫保存效果的影響 精子的存活和維持運動需要消耗能量，糖類作為能源物質，可為精子提供營養，補充精子能量。精子不能直接利用外界營養物質，而主要靠分解精子細胞內部的物質來獲取能量[8]。葡萄糖能穿過精子質膜為精子代謝提供能量，蔗糖不能穿過精子質膜，但能調節滲透壓，維持質膜穩定性，以利于精子存活[9]。本實驗結果顯示，基礎液中同時添加葡萄糖和蔗糖對馬鹿精子的保存效果略優于單一添加葡萄糖或蔗糖，這與曲宏偉等[10]的研究結果一致，這可能是與葡萄糖和蔗糖協同參與馬鹿精子能量代謝過程有關，即葡萄糖穿透精子質膜為精子代謝提供能量，而蔗糖不穿透精子質膜但其調節精子細胞滲透壓來維持精子質膜穩定性，從而延長精子的存活時間。有關葡萄糖和蔗糖怎樣協同調節馬鹿精子能量代謝過程有待進一步深入研究驗證。

3.2 BSA 對馬鹿精液常溫保存效果的影響 BSA 通過清除離子和小分子來平衡精子質膜兩側的滲透壓，并且阻止精子質膜與活性氧接觸發生過氧化反應，有效地保護精子質膜[11]。Rachmawati 等[12]報道，添加不同濃度的BSA 作為牛精液冷凍保護劑，可防止精液在冷藏過程中冷休克，其中0.2%BSA 為最適濃度。本研究顯示，馬鹿精液在常溫保存條件下稀釋液中添加0.2%BSA 時精子活力的保持情況最好，說明BSA 可以提高馬鹿精液的生存能力，這與庫爾班·吐拉克等[7]的研究結果一致。此外，本研究表明在精液稀釋液中添加0.2%BSA可有效延長馬鹿精子的存活時間。在現有研究中，BSA的最適添加濃度有所差異，可能是由于不同稀釋液和試驗動物品種之間的差異性所導致。本研究發現，少量或過多的BSA 都不利于馬鹿精子有效存活時間，說明少量的BSA 并不能起到馬鹿精液保存的作用，過多則會損害馬鹿精子，這與崔凱[13]研究結果一致。此外，BSA 對馬鹿精子頂體完整率沒有實質性的影響，這與劉玉等[14]研究結果一致，可能是BSA 通過穩定滲透壓、保護細胞膜的作用來延長精子有效生存時間有關，BSA對馬鹿精子頂體膜是否起到保護作用方面還得需要進一步深入研究。

3.3 大豆卵磷脂對馬鹿精液常溫保存效果的影響 稀釋液中添加適量的大豆卵磷脂可以改善精子的保存效果，最佳添加濃度應考慮大豆卵磷脂純度、基礎液成分、試驗動物等因素，有針對性的調整大豆卵磷脂濃度，從而得出試驗動物精液稀釋液中大豆卵磷脂的最佳濃度。本實驗中，在常溫條件下，馬鹿精液稀釋液中添加0.2%～0.3%大豆卵磷脂，馬鹿精子的存活時間顯著提高，而精子的頂體完整率與其他組沒有顯著變化，這與Akhter 等[15]研究結果相一致。近年來許多研究表明植物源性蛋白代替動物源性蛋白可以提高精液的保存效果，如等劉鑫[16]等發現在常規稀釋液中添加0.6%大豆卵磷脂能顯著提高豬精液4℃保存效果，Jessye 等[17]報道不含動物蛋白的稀釋液可以降低低溫保存的犀牛精液中禽類疾病傳播的風險，因此探尋更多除大豆卵磷脂之外的非動物源性添加物來替代卵黃具有重要意義。

3.4 卵黃對馬鹿精液低溫保存效果的影響 精液稀釋液中添加不同濃度的卵黃可以保護精子免受低溫損傷，卵黃中的低密度脂蛋白聚集在精子膜表面，可有效減少精子的冷休克。曾嘉慶等[18]研究表明，卵黃中的脂蛋白通過參與精子細胞膜的加固、修補和擴增等作用，進而影響精子活率。在精液保存過程中，隨著糖類營養物質的消耗，卵黃逐漸為精子代謝活動提供能量，進而延長了精液的保存時間，保護了頂體完整率，降低了隨著時間推移精液中產生的有害物質（如代謝廢物、細菌以及一些活性氧對精子）的損害作用[19]。本實驗表明，稀釋液中添加15%卵黃可以提高低溫（4℃）保存下馬鹿精子活力，并延長精子存活時間，這與張柳明等[20]的研究結果一致。這可能是與卵黃中的低密度脂蛋白聚集在馬鹿精子膜表面有效減少精子的冷休克有關。

3.5 冬眠合劑對馬鹿精液低溫保存效果的影響 已有報道稱人工合成的冬眠合劑有利于精液低溫保存[6]。本研究中，馬鹿精子在低溫（4℃）條件下保存，當冬眠合劑添加到5%時，馬鹿精子的活力和存活時間均極顯著提高，但精子的頂體完整率沒有顯著變化。這可能是冬眠合劑增強馬鹿精子質膜抗氧化能力，降低精子過氧化損傷，從而延長了精子保存時間，另外冬眠合劑中的氯丙嗪是鈣調蛋白抑制劑，有效降低精子對鈣離子的反應，減少其能量消耗，從而延長其保存時間。但精子頂體完整率很可能不受冬眠合劑的影響，有關此方面仍需要進一步深入研究驗證。另外，本實驗設計的冬眠合劑最高濃度為5 %條件下，馬鹿精子活力及存活時間極顯著高于其他組，基于更高濃度的冬眠合劑是否更有利于馬鹿精子低溫保存，有待于進一步實驗。本實驗用到的冬眠合劑主要成分為氯丙嗪和異丙嗪，均屬于吩噻嗪類藥物。由于吩噻嗪核極易被氧化，表現出很強的細胞抗氧化能力[21]，因此氯丙嗪和異丙嗪可以通過降低精子的過氧化損傷，增加精子保存時間和存活率。已有研究表明，氯丙嗪和異丙嗪通過改變葡萄糖代謝[22]和抑制葡萄糖攝取[23]來抑制細胞被氧化。基于氯丙嗪和異丙嗪是否參與馬鹿精子葡萄糖代謝過程有待進一步深入研究。

4 結 論

本實驗結果顯示，基礎稀釋液中同時等量添加0.1%葡萄糖和蔗糖、常溫保存稀釋液中添加0.2% BSA 和0.2%大豆卵磷脂、低溫保存稀釋液中添加15%卵黃和5%冬眠合劑有利于馬鹿精液的保存。

致謝：本實驗得到了新疆昌吉市盛華馬鹿繁育基地及工作人員的大力支持和幫助，為此表示感謝。