兔卵巢顆粒細胞分離培養條件的優化

靳榮帥，陳 實，周 娟，白少成，張 琛，姚 凡，陳 陽，吳信生

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225000）

卵巢顆粒細胞存在于雌性動物卵泡腔內，一般顆粒細胞可分為兩大類，一類是包裹在卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞，一類是排列在卵泡壁上的壁層顆粒細胞[1]。包裹卵母細胞的卵丘顆粒細胞會在排卵前發生擴散，排卵后壁層顆粒細胞會發生黃體化形成粒黃體細胞，之后與膜細胞形成黃體，這一過程對維持妊娠至關重要。卵泡的發育及排卵依賴于卵巢顆粒細胞和卵母細胞之間的高度協調發育，而這種高度協調發育主要通過2 種細胞之間持續、復雜、雙向的信號交流完成[2-3]。卵丘顆粒細胞與卵母細胞之間通過微絨毛形成縫隙連接，2 種細胞通過縫隙連接完成營養物質、初級代謝產物和一些信息分子的傳遞，進而促進2 種細胞的生長和分化，使兩者達到高度協調發育[4-5]。此外，卵母細胞無法有效利用葡萄糖產生能量，只能利用顆粒細胞代謝產生的羧酸進行氧化磷酸化反應產生發育所需的能量[3,6]。也有研究表明卵丘顆粒細胞所產生的丙酮酸可為卵母細胞發育提供重要的支持[7-8]。因此，兔卵巢顆粒細胞對卵母細胞的成熟及卵泡的正常發育都有著至關重要的作用。

在前期研究中，利用含10%胎牛血清的DMEM 培養基進行原代兔卵巢顆粒細胞培養，發現細胞生長增殖速度較慢。為優化兔卵巢顆粒細胞體外培養體系，本實驗在體外分離鑒定了兔卵巢顆粒細胞，并優化了培養條件，為卵巢顆粒細胞在體外調節卵母細胞發育和代謝等后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選擇4～6 月齡性成熟新西蘭白兔母兔，由揚州市某兔場提供。

1.2 實驗試劑 胎牛血清為Gibco 產品（A31610-01）；DMEM/F-12 基礎培養基為Hyclone 產品（AF29527017）,DMEM 基礎培養基為Hyclone 產品（C11885500BT）；雙抗（青鏈霉素混合液100×）,TritonX-100，4%組織細胞固定液均為索萊寶公司產品；Anti-FSHR 抗體為Affinity 產品；羊抗兔IgG H&L（FITC）為Abcam 產品。

1.3 兔卵巢顆粒細胞分離 準備2 只4～6 月齡的新西蘭白兔母兔，每只肌肉注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）80 IU，6 h 后用耳緣靜脈栓塞法處死兔子。為保證卵巢在運輸過程中保持新鮮，將兔子雙側卵巢放入預冷的PBS（含1%雙抗，pH 為7.4）中，帶入細胞間。首先將采集的卵巢組織放置于無菌培養皿（60×15 mm）中，用PBS 清洗2 遍。將卵巢組織放入加有雙抗（100 IU/mL青霉素和鏈霉素）的DMEM（高糖）培養液的無菌培養皿中，用1 mL 注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，使卵泡內容物釋放于其中。然后用200 目不銹鋼細胞篩過濾。收集到的濾液1 000 r/min 離心5 min，棄上清。向沉積在離心管底部的細胞團加入2 mL 紅細胞裂解液，裂解5 min 后1 000 r/min 離心5 min，棄上清液。向沉積在離心管底部的細胞團加入DMEM（含10%胎牛血清1%雙抗）制成細胞懸液，細胞懸液接種到6 孔板中，在5%CO2，37.0℃條件下孵育24 h。

1.4 免疫熒光法鑒定兔卵巢顆粒細胞 針對卵泡刺激素受體（Follicle-Stimulating Hormone Receptor，FSHR）在 顆粒細胞中特異性表達的特點，采用細胞免疫熒光法對體外培養的顆粒細胞進行鑒定。首先吸除培養24 h 后的原代顆粒細胞舊培養基，用PBS 清洗3 次，每次5 min。4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min。PBS 漂洗3 次，每次5 min。0.3% TritionX-100 處理60 min，PBS 洗3次，每次5 min。1% BSA 室溫封閉60 min。吸出封閉液，不洗。吸棄封閉液，加入一抗（anti-FSHR，1:250），4℃孵育過夜。PBST 漂洗3 次，每次5 min。將1:2000比例稀釋好的FITC 二抗滴加其中，37℃孵育60 min。PBST 漂洗3 次，每次5 min。滴加DAPI，室溫染色10 min 左右。熒光顯微鏡下觀察顯色，拍照保存。

1.5 兔卵巢顆粒細胞培養 DMEM 和DMEM/F-12 培養基都是細胞培養常用的培養基。前期在原代兔卵巢顆粒細胞培養過程中首先使用了含10%胎牛血清的DMEM培養基，發現細胞生長速度較慢，推測有可能是因為血清濃度和培養基不合適所致。因此，本實驗分別用血清濃度為5%、10%、15% 的DMEM/F-12 培養基培養兔卵巢顆粒細胞，以期獲得最適合兔卵巢顆粒細胞生長的培養基和血清濃度。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖狀況 細胞在24 孔板內培養48 h 后，將細胞分別接種于4 個96 孔板內以檢測0、24、48、72 h 時的細胞增殖狀況。待細胞貼壁后吸出培養基。由于2 種培養基顏色不同，會影響吸光值，因此棄掉原培養基后加入100 μL 的DMEM/F-12 培養基，在每孔內分別加入10 μL 的CCK-8 溶劑，放入細胞培養箱孵育4 h，放入酶標儀測量吸光值A450，記為0 h。以后每24 h 用同樣的方法測量1 次，共4 次。最后，以吸光值為縱坐標、時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.7 統計分析 細胞增殖的數據處理及增殖折線圖的繪制均使用GraphPadPrism8 軟件進行。

2 結果

2.1 兔卵巢顆粒細胞分離與鑒定 如圖1 所示，體外分離培養24 h 后，兔卵巢顆粒細胞呈單層貼壁性增長，形態為不規則的多邊形。利用卵巢顆粒細胞特異性蛋白FSHR 進行免疫熒光檢測，發現視野中呈現綠色熒光，證實分離的細胞為顆粒細胞（圖2）。

圖1 兔卵巢顆粒細胞形態圖

圖2 免疫熒光染色圖

在細胞鑒定完成后，對卵巢顆粒細胞進行傳代培養，結果如圖3 所示，可以明顯觀察到顆粒細胞出現分化。

圖3 第2 代兔卵巢顆粒細胞形態圖

2.2 不同濃度血清和培養基對細胞生長狀態的影響 在DMEM 和DMEM/F-12 培養基中分別加入5%、10%、15%的胎牛血清，在卵巢顆粒細胞接種密度一致的前提下，培養48 h 后細胞生長情況如圖4 所示，隨著血清濃度增加2 種不同培養基中細胞匯合度都在不斷增加，其中在含有15% 血清的DMEM/F-12 條件下培養的細胞匯合度最高，可達60%左右。

圖4 不同血清濃度和培養基下細胞生長狀況

2.3 不同濃度血清和培養基對細胞增殖的影響 如圖5所示，在加入15% 血清的DMEM/F-12 條件下細胞增殖速度最快。在5%血清條件下，培養72 h 后DMEM/F-12 組細胞增殖效果高于DMEM 組（P＜0.05）；在10%血清條件下，DMEM/F-12 組細胞增殖效果在48 h時高于DMEM 組（P＜0.05），在72 h 時極顯著高于DMEM 組（P＜0.01）。在3 種不同血清濃度條件下，DMEM/F-12 組細胞的增殖情況均優于DMEM 組。

圖5 不同血清濃度和培養基下細胞增殖狀況

3 討 論

卵泡顆粒細胞可分為圍繞卵母細胞的卵丘細胞和圍繞卵泡壁的壁顆粒細胞。其中，壁顆粒細胞的主要功能是參與細胞分化和信號轉導，卵丘細胞的主要功能是參與細胞增殖和代謝[9-10]。排卵后顆粒細胞會分化為黃體細胞，并分泌孕酮來調節卵巢的功能[11]。在體內，卵母細胞在發育過程中很難吸收利用氨基酸，只能通過縫隙連接利用由卵丘細胞攝取的氨基酸，即顆粒細胞間接促進了卵母細胞代謝的完成[8]。在體外培養過程中，一定濃度的顆粒細胞可以提高受精卵的發育能力[12]。此外，顆粒細胞上具有FSH 受體和雌激素受體，分別可以和FSH 與雌激素相結合產生多種信號分子，從而促進卵母細胞生長、顆粒細胞增殖及卵泡發育成熟和排卵[9]。可見，顆粒細胞既是卵泡的重要組成部分，也是影響卵巢功能的核心單位。

在細胞培養研究領域，大多數研究都采用DMEM和DMEM/F-12 兩種基礎培養液[13-17]。血清中含有大量的蛋白質、脂肪等營養物質和一些促生長因子，有研究使用添加10%胎牛血清的DMEM 培養基對小鼠顆粒細胞進行體外培養，結果得到的顆粒細胞純度高、增殖能力強[17]。此外，在豬[14]、牛[15]、鹿[18]卵巢顆粒細胞細胞體外培養液中，均有研究者添加了血清且細胞增殖狀況良好。在實驗過程中綜合多種因素，首先采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養基對兔顆粒細胞進行體外培養，為下一步細胞鑒定實驗做準備。FSHR 僅存在于卵巢顆粒細胞上[19-20]，因此可以通過測定FSHR 蛋白的表達水平來鑒定兔卵巢顆粒細胞。本實驗中，兔卵巢顆粒細胞經免疫熒光染色后，其胞質呈現綠色熒光，說明細胞上的FSHR 已經與FSHR 抗體相結合了，而被DAPI 染色的細胞核則呈藍色。

在體外培養條件下，本實驗中含有15% 血清的DMEM/F-12 條件下細胞數量最多，生長狀況最好。而高亞可[11]研究表明最適合水牛卵巢顆粒細胞體外培養的條件為含有10%血清的DMEM 培養液，與兔有所不同。這也說明了不同動物卵巢顆粒細胞對培養基的要求有所不同。為了更準確地探究不同條件下顆粒細胞的增殖效果，實驗采用CCK-8 法對細胞活性進行檢測。其原理是通過酶標儀測量該細胞液的吸光度值,便可檢測出待測細胞樣品的活性[21-22]，由此便可知細胞的增殖狀況。本研究中，DMEM 培養液中的細胞在任何血清濃度下的增殖效果都優于DMEM 中培養的細胞，并且在10%血清濃度下有極顯著差異；此外，隨著血清濃度增加，OD 值也在不斷增加，并在15%血清濃度下趨于平穩。這進一步說明了含有15% 血清的DMEM/F-12 培養基更適合兔卵巢顆粒細胞的體外培養。

4 結 論

本實驗條件下，兔卵巢顆粒細胞可以通過FSHR 抗體免疫熒光鑒定，兔卵巢顆粒細胞在含有15% 血清的DMEM/F-12 培養基中生長狀況優于含5%、10% 血清的培養基。