膽汁酸受體與豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析

孫麗娟，羅 培，趙偉杰，譚偉豪，李永祥，陳履雙，王麗娜*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510000；2.廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510000）

骨骼肌作為人類和動物軀體的重要組成部分，約占人類和動物體總體重的40%[1]。骨骼肌的生長發(fā)育過程受到多種生長因子和遺傳環(huán)境因素的共同影響，有關(guān)骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制尚不完全明了，與其相關(guān)的功能基因一直是研究熱點(diǎn)。其中，生肌調(diào)節(jié)因子（Muscle Regulatory Factors，MRFs）基因家族控制著肌肉的發(fā)育，包括從前體肌細(xì)胞的定型、增殖及肌纖維的形成，直到個體出生后肌肉的成熟和功能的完善性整個過程[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，該家族編碼4 種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子，分別是生肌決定因子（Myogenic Determining Factor，MyoD）、肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MyoG）、生肌因子5（Myogenic Factor 5，Myf5）和生肌因子6（Myo genic Factor 6，Myf6），它們是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，共同控制肌肉的生成[3]。MyoD和Myf5基因在成肌細(xì)胞增殖過程中表達(dá)，主要參與生肌過程，MyoG與Myf6主要負(fù)責(zé)肌肉分化[4]。MyoG在分化末期表達(dá)，Myf6基因主要在出生后表達(dá)，通過調(diào)控收縮蛋白和調(diào)節(jié)蛋白同工型在不同時期的表達(dá)使肌肉細(xì)胞分化為成熟的肌纖維。

成熟后的肌纖維根據(jù)骨骼肌肌纖維（MyHC）同工型表達(dá)模式所分出的4 種類型（I 型、IIa 型、IIb 型與IIx 型）表現(xiàn)出不同的生理功能與代謝特征，其中I 型和IIa 型肌纖維表現(xiàn)出氧化代謝特性，而IIb 型和IIx 型肌纖維表現(xiàn)出糖酵解特性[5]。不同類型的肌肉由于肌纖維類型的差異也往往會呈現(xiàn)出體積上的差異，I 型肌纖維直徑較細(xì)，而II 型直徑較粗。

然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌中也有膽汁酸受體的表達(dá)。膽汁酸受體主要包括法尼酯X 受體（Farnesol-X-Receptor，F(xiàn)XR）和G 蛋白偶聯(lián)受體TGR5（the G-protein Coupled Receptor 5，GPBAR1）[6]。FXR 作為第一個被發(fā)現(xiàn)的膽汁酸天然內(nèi)源性配體，其在體內(nèi)糖脂代謝穩(wěn)態(tài)中的作用已經(jīng)被多項(xiàng)研究所驗(yàn)證。FXR 激動劑Fexaramine 可顯著改善血糖水平，并減少飲食誘導(dǎo)的體重增加[7]。同時，F(xiàn)XR 激活后還可以通過調(diào)控肝臟脂肪代謝保護(hù)骨骼肌免于出現(xiàn)脂毒性的癥狀[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，全身性基因敲除FXR 的小鼠和腸道缺乏FXR 的小鼠口服葡萄糖后，耐受量可顯著改善且體重降低[9-10]。相關(guān)試驗(yàn)證明，F(xiàn)XR 可以介導(dǎo)CDCA（鵝脫氧膽酸）促進(jìn)小鼠胚胎肝細(xì)胞的增殖和分化[11]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，膽汁酸通過與肝細(xì)胞中的FXR 結(jié)合，發(fā)揮類固醇激素的作用，從而反饋調(diào)節(jié)自身的合成[12]，在小腸中，F(xiàn)XR 被高水平膽汁酸激活后誘導(dǎo)FGF19（或者小鼠FGF15）的轉(zhuǎn)錄和分泌，F(xiàn)GF15/19 通過門靜脈進(jìn)入肝細(xì)胞，激活FGF 受體4（FGFR4）/β-Klotho 的復(fù)合物，形成的復(fù)合物能夠抑制CYP7A1和CYP8B1基因的轉(zhuǎn)錄[13]，且研究表明，給小鼠肌肉注射FGF19 可以誘導(dǎo)其骨骼肌肥大，調(diào)節(jié)骨骼肌質(zhì)量并改善小鼠的肌肉消耗[14]。TGR5 作為研究最為深入的膜結(jié)合G 蛋白偶聯(lián)受體，其在體內(nèi)多個組織中均有表達(dá)，膽汁酸是目前已知的TGR5 的唯一內(nèi)源性配體[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，從TGR5-/-雄性小鼠肌肉中提取的肌管和分離出的肌纖維會產(chǎn)生萎縮狀態(tài)，當(dāng)用膽酸（CA）和脫氧膽酸（DCA）處理分離出的肌纖維培養(yǎng)物后，會增加其肌纖維直徑和肌球蛋白重鏈（MyHC）蛋白表達(dá)水平以及降低Atrogin-1 和MuRF-1 等萎縮蛋白的表達(dá)水平[16]。Sasaki 等[17]發(fā)現(xiàn)TGR5 在骨骼肌中的功能主要是調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化，改善由肌肉萎縮所產(chǎn)生的肌肉重量降低。除此之外，有研究還發(fā)現(xiàn)膽汁酸通過TGR5 誘導(dǎo)Dio-2 表達(dá)，使T4 轉(zhuǎn)化為T3 并且降低骨骼肌中的胰島素抵抗水平[18-19]。

目前，大多數(shù)研究主要是關(guān)于膽汁酸受體在肝臟和腸道中的作用，而其在骨骼肌發(fā)育過程中的調(diào)控作用及機(jī)制研究還很少。有研究發(fā)現(xiàn)，肌肉特異性基因敲除TGR5的小鼠會表現(xiàn)出較低的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度，同時也會降低骨骼肌中與肥大和分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，而TGR5 激活則可增強(qiáng)肌細(xì)胞分化和肌肉肥大[17]。可見，膽汁酸受體很可能與骨骼肌生長發(fā)育有密切聯(lián)系。

萊蕪豬是我國優(yōu)良的土種豬，肉質(zhì)鮮美。但是與外來品種相比有生長速度慢、產(chǎn)肉率低等缺點(diǎn)。為了探究膽汁酸受體是否參與了萊蕪豬和杜洛克肌肉生長發(fā)育差異的形成，本研究采用Western Blot、qRT-PCR 和ATP酶染色等技術(shù)檢測了2 個品種斷奶仔豬背最長肌和腰大肌中膽汁酸受體和肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，然后進(jìn)行相關(guān)性分析，從而探究它們之間的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步研究膽汁酸受體在骨骼肌發(fā)育過程中的作用機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取12 頭同一胎次、健康狀況良好的21 日齡杜洛克（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬場）和萊蕪斷奶仔豬（來自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬場），公母各6 頭，采集背最長肌、腰大肌和血液樣本。所有組織樣品采集后，經(jīng)液氮速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，美國Gene 有限公司；電泳儀，美國Bio-Rad 公司；垂直電泳槽，美國Bio-Rad 公司；蛋白印記轉(zhuǎn)移槽，美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；實(shí)時熒光定量PCR 儀，美國Life Technologies 公司；冰凍切片機(jī)，德國Leica 公司。

1.3 主要試劑β-actin 抗體、Tubulin 抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗，美國Bioworld Technology 公司；FXR 抗體，美國Abcam 公司；TGR5 抗體，美國Novus 公司；MyoD 抗體，正能生物科技有限公司；MyoG 抗體，美國Abcam 公司；RNA 快速提取試劑盒，廣州美基生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Western Blot快速制膠試劑盒，美國Bio-Rad 公司；琥珀酸脫氫鈉（SDH），北京索萊寶科技有限公司；腺苷三磷酸二鈉鹽（ATP），北京索萊寶科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測 取肌肉組織提取總蛋白，經(jīng)樣品蛋白質(zhì)濃度測定（BCA 法）、樣品測定、蛋白質(zhì)變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、顯影、定影后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.4.2 實(shí)時熒光定量PCR 測定基因mRNA 相對表達(dá)量將肌肉樣品取出40～50 mg，提取總RNA，具體操作按Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行，用RNA 濃度儀（Thermo Nano Drop Lite）檢測RNA 濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme 公司，R323-01，20 μL 反應(yīng)體系）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按說明書指示進(jìn)行。按熒光定量試劑盒（Vazyme 公司，Q111-02，20 μL 反應(yīng)體系）具體操作按說明書指示進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱10 min，循環(huán)1 次；（95℃，15 s；55～62℃，15 s；72℃，40 s），循環(huán)40 次，（95℃，60 s；55～62℃，30 s；95℃，30 s），循環(huán)1 次。每個樣品作6 個重復(fù)，以β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 相對表達(dá)量。引物序列由NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得，使用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)引物序列

1.4.3 ATP 酶酸染測定肌纖維類型 取新鮮肌肉組織放置到提前降溫至-24℃的冰凍切片機(jī)中平衡30 min 后，經(jīng)修剪、包埋、切片、染色、封片后，使用顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行切片觀察和圖像采集，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異分析。采用t-test 檢測比較兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有數(shù)據(jù)均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S.E）表示，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬血清膽汁酸含量差異 本實(shí)驗(yàn)分別檢測了杜洛克和萊蕪豬斷奶仔豬血清中的總膽汁酸含量和各種單體膽汁酸含量。結(jié)果顯示，萊蕪豬與杜洛克斷奶仔豬血清總膽汁酸含量無差異（P＞0.05）（圖1A、C）。萊蕪豬雌性斷奶仔豬血清中石膽酸（LCA）含量低于杜洛克（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 杜洛克與萊蕪豬斷奶仔豬血清膽汁酸水平

2.2 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬骨骼肌膽汁酸受體表達(dá)水平由圖2 所示，在雄性斷奶仔豬，杜洛克與萊蕪豬背最長肌和腰大肌中FXR 和TGR5 的表達(dá)均無差異（P＞0.05）（圖2B、C、H、I）；在雌性斷奶仔豬，萊蕪豬背最長肌中TGR5 蛋白水平和TGR5mRNA 水平低于杜洛克（P＜0.05），F(xiàn)XR 蛋白水平有低于杜洛克的趨勢（P=0.06），而FXRmRNA 水平低于杜洛克（P＜0.01）（圖2E、F），腰大肌中FXR的mRNA 水平高于杜洛克（P＜0.05）（圖2L）。

圖2 杜洛克與萊蕪豬斷奶仔豬肌肉中膽汁酸受體表達(dá)

2.3 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬骨骼肌肌纖維分型 如圖3所示，在雄性斷奶仔豬，萊蕪與杜洛克背最長肌和腰大肌中3 種肌纖維類型的mRNA 水平均無差異（P＞0.05）（圖3A、B）；在雌性斷奶仔豬，萊蕪豬腰大肌中MHCΠb的mRNA 水平低于杜洛克（P＜0.05）（圖3D），而萊蕪豬與杜洛克背最長肌中3 種肌纖維類型的mRNA水平均無差異（P＞0.05）（圖3C）。

圖3 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬肌肉中肌球蛋白重鏈表達(dá)

在檢測了3 種肌球蛋白重鏈的mRNA 水平基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用ATP 酶染色進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，雄性斷奶仔豬中萊蕪豬背最長肌中MHCI 的分布比例有高于杜洛克的趨勢（P=0.088），而MHCIIb 的分布比例有低于杜洛克的趨勢（P=0.061）（圖4C）；腰大肌中MHCI 的分布比例高于杜洛克（P＜0.01），而MHCIIb 的分布比例低于杜洛克（P＜0.01）（圖4D）；雌性斷奶仔豬中杜洛克與萊蕪豬腰大肌中3 種肌纖維類型的分布比例無差異（P＞0.05）（圖4E）。

圖4 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬肌肉中肌纖維類型

2.4 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬骨骼肌生肌因子的表達(dá) 如圖5 所示，在雄性斷奶仔豬，萊蕪背最長肌中MyoG的mRNA 水平低于杜洛克（P＜0.05）（圖5C），腰大肌中生肌因子的表達(dá)水平均無差異（P＞0.05）；雌性斷奶仔豬中萊蕪豬背最長肌中MyoD和MyoG的mRNA 水平低于杜洛克（P＜0.05），而Myf6的mRNA 水平高于杜洛克（P＜0.001）（圖5F），腰大肌中Myf5和Myf6的mRNA 表達(dá)水平高于杜洛克（P＜0.05）（圖5L）。

圖5 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬肌肉中生肌因子

2.5 杜洛克與萊蕪斷奶仔豬骨骼肌膽汁酸受體和肌肉發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析 本研究發(fā)現(xiàn)，萊蕪和杜洛克斷奶仔豬肌纖維類型存在差異，并且跟性別有關(guān)。肌肉發(fā)育相關(guān)基因的差異主要出現(xiàn)在2 個品種的雌性斷奶仔豬中，同時血清中LCA 水平和骨骼肌中膽汁酸受體的表達(dá)水平均在2 個品種的雌性斷奶仔豬中出現(xiàn)差異（P＜0.05）。基于此，針對雌性斷奶仔豬骨骼肌中膽汁酸受體表達(dá)水平和生肌因子的表達(dá)情況進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)性分析。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜洛克豬骨骼肌中，TGR5在背最長肌中的表達(dá)與Myf5正相關(guān)（P＜0.05），而在腰大肌中TGR5的表達(dá)與MyoG和Myf6正相關(guān)（P＜0.05）（圖6A、B）。然 而TGR5與Myf5、MyoG以 及Myf6在萊蕪豬中無相關(guān)性（P＞0.05）（圖6C、D）。另一方面，F(xiàn)XR在杜洛克和萊蕪豬的背最長肌和腰大肌中的表達(dá)跟4 個生肌因子的表達(dá)也出現(xiàn)相關(guān)性，但并無明顯規(guī)律（圖6A、B、C、D）。

圖6 杜洛克與萊蕪雌性斷奶仔豬肌肉中膽汁酸受體和生肌因子的相關(guān)性

基于上述結(jié)果，快速生長的瘦肉型豬杜洛克豬肌肉中生肌因子的表達(dá)與TGR5 的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，而在萊蕪豬似乎喪失了這種相關(guān)性。因此，推測膽汁酸受體TGR5 在萊蕪豬和杜洛克豬肌肉生長發(fā)育特性差異形成過程中可能扮演了一定的角色。

3 討 論

近年來的研究已經(jīng)證實(shí)，膽汁酸作為一個重要的信號調(diào)節(jié)分子，能夠激活膽汁酸受體并參與機(jī)體膽汁酸代謝、糖脂代謝、能量代謝以及機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等過程，具有廣泛的生物學(xué)作用[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)不同品種豬血清中膽汁酸組成存在差異，萊蕪雌性斷奶仔豬血清中LCA 含量顯著低于杜洛克。與此同時，骨骼肌中膽汁酸受體的表達(dá)存在明顯的品種和性別差異，TGR5 在萊蕪雌性斷奶仔豬背最長肌中的表達(dá)水平顯著低于杜洛克，且背最長肌中FXR的mRNA 表達(dá)水平極顯著低于杜洛克，而這些基因表達(dá)差異在雄性斷奶仔豬骨骼肌中無顯著性。很多研究表明，血清膽汁酸與各組織膽汁酸受體的表達(dá)存在相互調(diào)控的作用。Vassileva 等[22]認(rèn)為膽囊膜上的TGR5 激活后通過介導(dǎo)尖端鈉依賴性膽鹽運(yùn)輸體（ASBT）促進(jìn)胞外膽汁酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)，使血清的膽汁酸濃度升高，反饋性地抑制了肝細(xì)胞中的CYP7A1，從而使膽汁酸合成減少，而血清及膽汁中膽固醇增多，故易形成膽結(jié)石。而Sinal等[23]已經(jīng)證實(shí)FXR-/-小鼠能夠誘導(dǎo)肝臟膽汁酸水平升高和肝臟損傷，進(jìn)而引起肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，有研究表明，在膽道阻塞時，膽汁酸濃度的上升會刺激FXR 的表達(dá)上調(diào)，并隨阻塞時間延長，F(xiàn)XR 蛋白表達(dá)增高相對緩慢，同時FXR 的激動劑——CDCA 可以減輕膽道阻塞后大鼠肝臟損傷[24]。Kobayashi 等[25]對55 位中年的非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者進(jìn)行血清膽汁酸及代謝指標(biāo)測定，通過Spearman 試驗(yàn)顯示，血清中CDCA 與下肢骨骼肌體積（SMV）呈正相關(guān)，CDCA 含量增加引起SMV 水平升高。除此之外，有研究報(bào)道血清膽汁酸對減重手術(shù)的代謝有促進(jìn)作用，并且通過激活膜受體TGR5，膽汁酸能夠增加能量消耗以及改善糖脂代謝[26]。由此可見，膽汁酸與膽汁酸受體之間存在同向調(diào)控。本研究中也發(fā)現(xiàn)萊蕪雌性斷奶仔豬血清中LCA 含量降低可能會導(dǎo)致肌肉中TGR5 和FXR 的表達(dá)水平降低。

肌肉發(fā)育相關(guān)基因的研究結(jié)果顯示，在雌性斷奶仔豬，只有生肌因子的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著差異，而肌纖維類型無差異。推測膽汁酸主要通過其受體影響生肌因子的表達(dá)以及肌纖維的發(fā)育。背最長肌中MyoD的mRNA 表達(dá)顯著低于杜洛克，而背最長肌和腰大肌中Myf6的mRNA 表達(dá)顯著高于杜洛克。近年來關(guān)于骨骼肌發(fā)育的相關(guān)功能基因的研究一直是熱點(diǎn)，豬骨骼肌中肌肉發(fā)育基因的表達(dá)在決定肌肉生長發(fā)育和中間差異中起著重要作用[27]。Yoichiro 等[28]發(fā)現(xiàn)梅山豬在其妊娠第75 天及出生時骨骼肌肌纖維的總量遠(yuǎn)少于西方瘦肉型豬種——大白豬，而這種差異直接導(dǎo)致大白豬出生后肌肉發(fā)育能力遠(yuǎn)高于梅山豬。Zhonglin 等[29]通過基因表達(dá)長序列分析（LongSAGE）技術(shù)，獲得了通城豬和長白豬性交后33、65 d 和90 d 的骨骼肌轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)長白豬的肌肉生長因子和蛋白質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，同時定量分析結(jié)果顯示，這些基因在通城豬肌肉的表達(dá)下調(diào)，且其肌肉生長速度較為緩慢。推測這些差異形成可能和肌肉中膽汁酸受體表達(dá)差異有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)差異主要出現(xiàn)在兩品種的雌性斷奶仔豬中，并且血清中LCA 水平和骨骼肌中膽汁酸受體表達(dá)水平均在兩品種的雌性斷奶仔豬中出現(xiàn)顯著差異。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，快速生長的瘦肉型豬杜洛克豬肌肉中生肌因子的表達(dá)與TGR5的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，而在萊蕪豬肌肉中似乎喪失了這種相關(guān)性。已有研究證明，循環(huán)總膽汁酸與骨骼肌體積有關(guān)聯(lián)，12-羥基甾醇膽汁酸（包括脫氧膽酸）與骨骼肌體積減小有關(guān)[30]，同時有關(guān)試驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了在肉雞日糧中添加60 mg/kg 和80 mg/kg 的膽汁酸可以顯著提高腿肌重量[31]，而在妊娠母鼠日糧中添加植物甾醇酯（PE）可以影響母胎間膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)及脂質(zhì)代謝，并且可能通過膽汁酸受體的作用促進(jìn)子代肌肉發(fā)育[32]。據(jù)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TGR5KO 小鼠會表現(xiàn)出較低的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度，并且會降低骨骼肌中與肌肉肥大和肌肉發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)，反之，激活TGR5 可增強(qiáng)肌細(xì)胞分化和促進(jìn)肌肉肥大[17]。這提示肌肉中膽汁酸受體可能與肌肉發(fā)育相關(guān)基因有關(guān)聯(lián)性，而該推測有待后期試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

綜上所述，骨骼肌中的TGR5 可能促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育，膽汁酸受體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的差異可能參與了不同品種豬肌肉生長發(fā)育表型差異的形成。