LncRNA 在畜禽抗病育種中的研究進展

郭澤慧，蘭 茜，李 祥，劉成利，黃勇富

（西南大學動物科學技術學院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400715）

長期以來，疾病是影響畜禽業發展的重要因素，在生產過程中大多通過加強管理和使用藥物等傳統方法以短期解決畜禽疾病問題，但這不能從根本上控制和解決疾病的流行[1]，且長期使用藥物會使機體產生耐藥性，也無法完全確保藥物在動物體內的殘留狀況。疾病的發生與遺傳和環境有關，因此可以從遺傳角度選擇抗病性較高的個體，提高整體群體抗病力[2]。

抗病能力關乎畜禽的健康水平，是影響畜禽生長和繁殖的重要因素[3]。現今研究較多的是轉基因技術和分子標記輔助選擇（Marker Assisted Selection，MAS），兩者從選擇抗性基因出發，改良品種，可以有效地進行抗病育種[4]。雖然從轉基因技術和分子育種等方面進行抗病選育可以在一定程度上改變畜禽的生長性能，但畜禽很多生物性狀不僅發生在DNA 水平，也會受到mRNA 轉錄水平及翻譯水平等影響，因此要考慮不同水平的影響，才能更加全面、準確地探究畜禽的抗病選育。長鏈非編碼RNA（Long non-coding，LncRNA）是一種長度大于200 bp 且不具編碼能力的RNA，LncRNA 可通過DNA 甲基化、基因組印記、組蛋白修飾等參與表觀遺傳及轉錄和轉錄后水平發揮調控作用，同時在機體的正常生長發育、細胞的增殖分化以及疾病的病變、癌癥等方面也發揮重要作用[5]。研究發現，當LncRNA 表達異常時，一方面可通過調節鄰近基因的表達參與宿主的抗病毒應答，另一方面可通過共表達的蛋白編碼基因的表達進行功能調控，在抗病育種中發揮重要作用[6-7]。LncRNA 給畜禽的抗病育種提供了新的研究思路。

隨著分子生物學、分子遺傳學和基因工程技術的發展，抗病育種也將成為提高畜禽抗病力的重要手段。畜禽遺傳改良工作者應將抗病性狀列為遺傳改良的目標性狀之一，通過使用現代遺傳學方法提高畜禽抗病力，加強畜禽機體免疫能力，來達到提高畜禽生產效率，促進畜禽業健康發展的終極目標。因此，本文綜述畜禽抗病育種的現狀及LncRNA 在畜禽疾病調控中的研究進展，揭示LncRNA 在畜禽抗病育種中的作用機制，以期為畜禽抗病育種工作提供一個新的視角。

1 LncRNA 調控作用機制

隨著高通量測序技術不斷發展，越來越多物種的基因圖譜被解析出來，研究發現基因組序列中只有2%可編碼蛋白，其余98% 的基因組序列不參與編碼功能，產生非編碼RNA（non-coding，ncRNA）。LncRNA 大多由RNA 聚合酶II 轉錄而來，存在于真核生物內，無開放閱讀框，LncRNA 在一些癌癥或腫瘤性疾病中發揮作用，在畜禽疾病研究中也具有重要功能[8]。

1.1 LncRNA 通過表觀遺傳學調控疾病發生過程 表觀遺傳學是指在基因序列不改變時基因表達可遺傳的現象，其在生物體的發生和腫瘤的發生中起著重要作用，LncRNA 通過作為信號、誘餌、向導和支架等作用機制，與DNA、組蛋白修飾酶、異染色質蛋白等結合，參與表觀遺傳調控[9-10]。例如，LncRNA-CASC9 表達失調可以引起食管癌等多種疾病，CASC9 通過與CBP 結合并修飾組蛋白乙酰化而上調LAMC2 表達，該研究表明CASC9 可作為疾病的預后生物標記物[11]。H19 和Xist是最早被發現參與表觀遺傳調控的2 個LncRNA。Xist參與牛乳腺上皮細胞的炎性反應，研究表明Xist 抑制由大腸桿菌或金黃色葡萄球菌引起的NF-κB 通路的磷酸化，抑制炎癥的發生，調節機體的免疫應答[12-13]。除此之外，在果蠅中，LncRNA-hsrω 與dFUS 蛋白相互作用，可以通過敲低LncRNA-hsrω 的表達來降低dFUS 表達，參與神經退行性疾病[14]。還有研究發現，大多數與疾病相關的LncRNA 利用染色質重塑結合招募特質的染色體復合物，進而影響機體調控[15]。例如，調控艾滋病病毒1 型（HIV-1）的LncRNA 招募含有DNMT3A這種脫氧核糖核酸甲基轉移酶的表觀重塑復合物，進而引起RNA 定向轉錄基因沉默，表明該LncRNA 可能參與了病毒潛伏期過程[16]。

1.2 LncRNA 通過轉錄水平調控疾病發生過程 轉錄水平的調控是LncRNA 參與基因調控的重要方式，在已知作用機制的LncRNA 中，大多數通過轉錄水平發揮調控作用。參與轉錄調控的LncRNA 可以與轉錄因子相互作用，激活或抑制下游基因的表達，也可與轉錄因子結合形成復合物調控鄰近蛋白編碼基因的表達，從而參與基因的轉錄過程[17]。例如LncRNAPvt1在白血病小鼠骨髓細胞中高表達，可通過轉錄因子MYC 發揮作用，而干擾Pvt1會引起骨髓分化表型[18]。另外，研究發現LncRNAMALAT1通過將轉錄因子Sp1 募集到啟動子LTBP3 來促進上游基因LTBP3的轉錄，在多發性骨髓瘤起調控作用[19]。

1.3 LncRNA 通過轉錄后水平調控疾病發生過程 研究表明，定位在細胞質中的LncRNA 多通過參與轉錄后水平調控基因表達過程，主要通過調控RNA 的剪切、加工、拼接，參與翻譯水平、調節蛋白活性以及通過競爭性內源RNA（Competing Endogenous RNAs，ceRNA）等發揮作用[20]。ceRNA 是RNA 間相互作用的一種新機制，已有很多LncRNA 通過ceRNA 調控靶基因的轉錄水平，如HSUR1、H19、CCAT1 等[21-23]。目前，ceRNA 在畜禽疾病中的研究相對較少，但同樣發揮著重要作用。例如，針對會引起神經性疾病并使哺乳動物的腦細胞持續性感染的Boran 病毒（BODV）研究中，Sun 等[24]研究發現LncRNA 在不同的BODV 菌株中發揮不同的調控作用，ceRNA 作用分析表明ENSMUST00000128469可能與 miR-22-5p、miR-206-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-1a-3p 相互作用調控細胞增殖、病毒感染等過程。另外，在牛上的研究發現，H19 在牛乳腺炎上皮細胞炎癥等疾病中發揮作用，H19 過表達可促進促炎因子表達，激活NF-κB 信號通路，影響脂多糖誘導的炎癥性牛乳腺上皮細胞的免疫反應，表明H19 可能在調節牛乳腺上皮細胞免疫反應中起作用[22]。ceRNA 在人類腫瘤疾病中研究相對較多，如在人類肝癌發生過程中，Peng 等[23]檢測肝癌組織和非肝癌組織中CCAT1 的表達，發現該LncRNA 在肝細胞癌組織中的表達明顯高于非肝癌組織中的表達水平，找到了與CCAT1 特異性結合的let-7 的內源性靶點HMGA2 和c-myc，并發現CCAT1 與let-7 競爭性結合可以明顯降低肝癌細胞的增殖和遷移。此外，有研究顯示ceRNA 作用機制也在胃癌[25]、食管鱗狀細胞癌[26]等癌癥及其他人類疾病如糖尿病[27]、心血管疾病[28]等都發揮著重要的調控作用。了解LncRNA在人類疾病中的相關研究可為探究LncRNA 在畜禽疾病中如何發揮作用及抗病育種提供參考。

LncRNA 作為一種在不同生物學過程中發揮重要作用的調控因子，還可以通過與一些結合蛋白結合、在蛋白質翻譯修飾后參與免疫反應[29]。例如，Li 等[30]研究表明 linc1992 THRIL 與hnRNPL 蛋白結合可調節腫瘤壞死因子的表達，說明在調控宿主與病原體的相互作用中發揮關鍵作用，參與機體先天免疫反應。

2 LncRNA 在抗病毒天然免疫反應中的作用

近年來，研究顯示LncRNA 通過相關的免疫信號通路誘導下游相關基因進行調控，在宿主抗病毒免疫反應中起關鍵調控作用[31]。病毒感染宿主細胞后，一方面通過影響宿主中LncRNA 的表達以達到感染目的，使病毒得到繁殖；另一方面，病毒通過改變自身LncRNA 的表達來調控宿主的表達，達到隱性感染的目的，宿主細胞通過模式識別受體來識別病原相關模式分子，激活宿主天然免疫反應，誘導抗病毒因子產生，進而誘發抗病毒天然免疫反應[32]。在病毒感染中，越來越多的LncRNA 已被證明通過調控干擾素（IFN）在多種病毒感染和抗病毒感染中發揮作用，IFN 在免疫信號通路中被誘發產生，激活干擾素刺激基因（ISGs）的轉錄，進而影響病毒的復制與發生，誘發抗病毒反應[33]。Hu 等[34]研究發現由IFN 和腫瘤壞死因子（TNF）介導抗病毒信號通路誘導LncRNA 差異表達，進而調節宿主免疫反應，包括病原體識別受體（PRR）相關信號轉導、轉錄因子的易位和活化、IFN 和細胞因子的產生、IFN激活的JAK-STAT 信號轉導以及抗病毒干擾素刺激基因的轉錄。劉洋等[35]以小鼠為實驗動物，用水皰性口炎病毒感染腹腔巨噬細胞，發現LncBC47 敲除可通過提高 IRF3 的磷酸化水平與Ⅰ型干擾素的產生來進行天然免疫應答，從而抑制水皰性口炎病毒感染。除IFN 以外，LncRNA 也可調節TNF、白介素（IL）、Toll 樣受體等[36]細胞因子來影響天然免疫反應，進而引發宿主的抗病毒反應。

隨著高通量測序技術的發展，通過轉錄組測序和生物信息學分析發現病毒感染引起的LncRNA 差異表達或失調，進而影響抗病毒反應，引起疾病發生（表1）。禽白血病[37]、馬立克氏病[38]、豬藍耳病[39]、豬腦心肌炎和水皰性口炎[40]等病毒是動物養殖過程中常見的病毒性疾病，會引起LncRNA 差異表達，參與抗病毒反應。禽白血病病毒和馬立克氏病病毒會引起雞的一些腫瘤性疾病，對雞的生長發育產生較大影響。Lan 等[37]通過轉錄組測序發現了17 個差異表達的LncRNA，可能在禽白血病感染過程中發揮作用，其中LOC-009715被證明與干擾素因子相互作用，參與先天免疫反應。You 等[38]通過測序分析在脾臟組織中鑒定出了5 個差異表達的LncRNA，這些差異表達的LncRNA 與抗馬立克氏病的候選基因高度相關。豬德爾塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）是一種新型的冠狀病毒，會引起豬腹瀉、嘔吐等，Tang 等[41]在感染的不同時期共篩選出了173 個可能與豬德爾塔冠狀病毒相關的差異表達的LncRNA。另外，在一些疾病相關研究中，研究者明確提出了LncRNA 表達與疾病的關系，例如在豬藍耳病研究中，甘立鵬[39]發現LncRNA TCONS_00179042 表達上調與豬感染繁殖與呼吸綜合征病毒有關。劉瑋等[40]利用轉錄組測序檢測發現LncRNA1 在豬腦心肌炎病毒、水皰性口炎病毒、單純皰疹病毒感染過程中表達量降低，提示在動物機體感染病毒后，LncRNA1 特異性負調控I 型干擾素和促炎因子的產生。

表1 LncRNA 在動物抗病毒免疫反應中的研究

高通量測序的發展使研究者們發現了很多與疾病相關的LncRNA，也揭示了一些與抗病毒天然免疫反應的LncRNA，表明在動物機體被病毒感染后，先天免疫應答引起的LncRNA 變化有助于闡明宿主對病毒的防御機制，使研究者們進一步加深了對病毒發病機理的了解。但目前的研究鮮有說明這些LncRNA 在抗病毒天然免疫反應中的具體作用機制，因此LncRNA 在抗病毒反應中的如何發揮作用，在抗病育種中如何具體應用還需要進一步探究。

3 LncRNA 在抗菌反應中的免疫調控作用

LncRNA 除了在抗病毒免疫反應中具有調控作用外，其在調節宿主對細菌感染的免疫和炎癥反應方面也發揮著重要作用。細菌是很多疾病的病原體，通過多種方式傳播，如分枝桿菌[42]、大腸桿菌[43-45]、金黃色葡萄球菌[46]、產氣莢膜梭菌[47]、沙門氏菌[48]等是生產養殖中常見的引起疾病的細菌，對動物健康造成很大影響。在養殖生產過程中，大多使用一些抗生素治療細菌感染，但長期使用可能會使動物機體產生一定的耐藥性，因此，進行疫苗研發或尋求新的治療方法是急迫的。

研究發現，LncRNA 可能通過調節自噬控制炎癥反應，對細胞抵抗細菌的能力產生影響[49]。如牛分枝桿菌感染巨噬細胞后，LncRNA MEG3 表達降低，進而抑制mTOR 和PI3K-AKT 信號傳導誘導細胞自噬，消除分枝桿菌[42]。另外，LncRNA 還通過調控一些蛋白、參與炎癥通路來參與疾病調控。奶牛乳腺炎是奶牛養殖過程中常見的一種炎癥，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎常見的致原菌，有研究顯示，奶牛乳腺上皮細胞發生炎癥時，LRRC75A-AS1 高表達，引起LRRC75A-AS1 mRNA 表達升高，細胞緊密連接蛋白降低，細菌對細胞的黏附和侵襲能力明顯升高，NF-κB 信號通路激活，從而參與乳腺上皮細胞的炎癥反應，表明降低LRRC75A-AS1 的表達量可以緩解奶牛乳腺炎[43]。除此之外，還有研究表明LncRNA-TUB 也可能參與奶牛乳腺炎的發生，在炎癥應答中發揮重要作用[46]。大腸桿菌種類多，除了可引起奶牛乳房炎外，也易引起動物腸道性疾病，如產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）易引起幼畜腹瀉。以小鼠為實驗動物的研究顯示，ETEC 在感染小鼠后，LncRNA ENSMUST00000122226 可能參與調控ETEC 引起的炎癥反應的發生[44]。大腸桿菌F7菌株是大腸桿菌的一個菌株，也會引起綿羊腹瀉，黃賽男等[45]以服用大腸桿菌F7 菌株獲得的腹瀉型和非腹瀉型綿羊肝臟組織為實驗樣本進行RNA-seq 測序，篩選得到34 個差異表達的LncRNA，分析發現這些LncRNA 富集到MAPK 信號通路、氧化磷酸化、綿羊甲狀腺激素信號通路等9 個重要通路。RNA-seq 測序的發展和應用使更多在抗菌反應中發揮作用的LncRNA被發現，如Huang 等[47]研究了C 型產氣莢膜梭菌感染仔豬后免疫應答中LncRNA 的調控作用，結果發現480 個差異表達LncRNA 和3369 個mRNA，可能通過PPAR 信號通路、趨化因子信號通路和Toll 樣受體信號通路調節仔豬的免疫反應，抵御C 型產氣莢膜梭菌感染。除此之外，該研究還發現差異表達的212 個LncRNA和505 個靶mRNA 與產氣莢膜梭菌感染病相關，25 個LncRNA 和13 個靶mRNA 顯示有抗細菌感染作用。

IFN 具有抗病毒、調節免疫的作用，LncRNA 通過IFN 在多種抗病毒感染中發揮作用，在抗菌反應中也進行調控。例如，沙門氏菌是一種常見的致病菌，存在一定的致病性，NeST 是一種基因間的LncRNA，研究發現NeST 通過表觀遺傳對干擾素-γ存在正向調節，具有抗腫瘤免疫特性[50]，參與沙門氏菌的調控。Gomez 等[48]研究證明NeST 通過促進小鼠體內IFN-γ的產生來促進沙門氏菌的清除；該研究也發現NEAT1/2 表達降低時機體易被沙門氏菌感染，揭示該LncRNA 的存在有助于宿主防御沙門氏菌感染。

細菌不僅在人類的生活中廣泛存在并發揮作用，其對畜禽養殖的影響也不容忽視。已有研究發現了很多與畜禽抗菌反應相關的LncRNA（表2），這些LncRNA一方面可以通過調節自噬控制細菌反應，一方面可以通過調控蛋白發揮抗菌作用，通過測序分析獲得了部分可能與抗菌反應相關的通路，但這些LncRNA 如何通過通路調控抗菌反應需要進一步研究。

表2 LncRNA 在動物抗菌反應中的研究

4 總結

畜禽疾病關系著國民經濟效益以及人類食品安全，同時，對養殖業的長期健康發展影響頗大，因此對畜禽進行抗病選育研究顯得尤為重要。近年來，LncRNA作用機制及功能研究受到越來越多研究者們的關注，LncRNA 已被證明通過多種調控形式介導免疫反應。近年來，隨著現代測序技術和生物信息分析技術的發展，發現了很多參與抗病毒和抗菌反應的LncRNA，并揭示了LncRNA 與疾病間存在調控關系，預測了LncRNA與下游基因或通路的調控機制，證明LncRNA 在畜禽疾病過程中發揮了重要作用。但LncRNA 具體通過哪些通路或基因發揮抗病毒和抗菌反應，如何參與疾病的調控還不清楚。隨著人們對LncRNA 的深入了解，將有更多的研究者通過篩選與疾病相關的LncRNA 并鑒定其功能進而挖掘出更多的LncRNA 作為畜禽抗病育種的遺傳標記，為抗病育種的應用提供選育遺傳位點，同時，有助于抗病育種在畜禽生態健康養殖中發揮重要作用。