EB病毒DNA拷貝量動(dòng)態(tài)分析對(duì)晚期鼻咽癌患者化療療效的預(yù)測價(jià)值*

喜 燕，唐 亮，艾力根·阿不都熱依木

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉診療中心，新疆烏魯木齊 830001

鼻咽癌(NC)是目前我國常見的惡性腫瘤之一，國內(nèi)外多個(gè)指南均指出EB病毒(EBV)在NC發(fā)生及發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用[1-2]。伴隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的日漸成熟，目前EBV-DNA載量與NC疾病發(fā)展、治療及預(yù)后之間的相關(guān)性研究較多，均指出其與NC患者上述疾病相關(guān)過程有密切關(guān)系[1-3]。目前，化療是針對(duì)晚期NC患者具有一定效果的治療手段，雖然既往有研究指出EBV-DNA表達(dá)水平與NC患者治療療效具有明顯關(guān)系[4]，但是將其動(dòng)態(tài)監(jiān)測的具體值用于預(yù)測NC患者化療預(yù)后的研究卻相對(duì)較少，故開展本研究，旨在為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)晚期NC患者療效提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)參考，進(jìn)一步完善晚期NC患者的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年1月于本院接受標(biāo)準(zhǔn)化療方案的晚期NC患者131例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合文獻(xiàn)[5]中對(duì)于NC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且達(dá)到TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的標(biāo)準(zhǔn)；(2)依從性較好，均表示能接受完整的治療周期；(3)年齡在18歲以上；(4)首次發(fā)現(xiàn)，之前未接受其他治療方式；(5)首次EBV-DNA檢測能測出EBV-DNA拷貝量。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他類型的惡性腫瘤；(2)伴有嚴(yán)重全身性慢性疾病；(3)對(duì)治療藥物不耐受；(4)1個(gè)月內(nèi)有免疫抑制劑使用史。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1動(dòng)態(tài)EBV-DNA監(jiān)測方案 分別于治療前后檢測患者血漿中EBV-DNA拷貝量，而后分別計(jì)算其前后差值及前后比值。

1.2.2EBV-DNA檢測方法 抽取患者清晨空腹靜脈血3 mL，離心后取血漿并采用天根生化科技(北京)有限公司提供的血清/血漿游離DNA提取試劑盒對(duì)血漿中DNA進(jìn)行提取，而后將提取后標(biāo)本與探針[序列為：5′-(FAM)CCAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAAGG(TAMRA)-3′]及寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司提供的Ex Taq酶混合后采用美國RocheBranch burg公司生產(chǎn)的LightCycler480熒光定量 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的目的基因來自EBV的BamH1-W片段，上、下游引物序列分別為F:5′-CCCAACACTCCACCACACC-3′；R:5′-TCTFAGGAG-CTGTCCGACCC-3′。反應(yīng)過程為：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，而后使用計(jì)算機(jī)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算反應(yīng)體系中DNA拷貝量，單位為copy/mL，并取對(duì)數(shù)。

1.2.3化療方案 所有患者均參照《耳鼻咽喉科疾病臨床診斷與治療方案》[6]中推薦的方式，采用文獻(xiàn)[7]中提供的第1天多西他賽75 mg/m2，第1～3天順鉑25 mg/m2；或第1天多西他賽60～75 mg/m2，第1～5天氟尿嘧啶500～750 mg/m2，第1～3天順鉑20～25 mg/m2方案。上述方案均21 d為1個(gè)周期，化療2～3個(gè)周期。根據(jù)患者具體情況有選擇性地制訂化療方案。

1.2.4放療方案 根據(jù)患者病情，部分需要增加放療，選擇調(diào)強(qiáng)方案為放療方案，靶區(qū)勾畫依據(jù)為國際輻射學(xué)單位委員會(huì)推薦的鼻咽癌放射治療靶區(qū)[8]。處方劑量[9]：大體鼻咽腫瘤靶區(qū)為66.0～70.2 Gy，大體腫瘤淋巴結(jié)靶區(qū)為66.0～70.2 Gy，臨床靶區(qū)為160～166 Gy，臨床靶區(qū)2 為50～56 Gy，1次/天，每周5次，共30～33次。危及器官限量參照美國腫瘤放射治療協(xié)作組相關(guān)規(guī)定[10]。

1.3觀察指標(biāo)及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1觀察指標(biāo) 包括臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查資料及影像學(xué)檢查資料。(1)臨床資料包括年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、TNM分期、化療方案及是否放療等；(2)實(shí)驗(yàn)室檢查資料包括血紅蛋白(Hb)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、纖維蛋白原(FIB)、D-二聚體(D-D)；(3)影像學(xué)檢查資料包括最大病灶最大徑、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。

1.3.2療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 患者完成全部治療后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1 版，有效例數(shù)=完全緩解(CR)例數(shù)+部分緩解(PR)例數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic分析療效的影響因素；建立受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析EBV-DNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測指標(biāo)對(duì)NC患者化療療效的預(yù)測價(jià)值，曲線下面積(AUC)的比較采用Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療前后EBV-DNA拷貝量及治療前后拷貝量差值、比值比較 患者經(jīng)過治療后獲得CR 21例，獲得PR 74例，有效共95例，故最終分為有效組95例，男61例，女34例；無效組36例，男21例，女15例。Logistic單因素分析結(jié)果顯示，有效組治療前后EBV-DNA拷貝量均明顯低于無效組，而治療前后其拷貝量比值明顯高于無效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2兩組患者的臨床資料分析 有效組放療例數(shù)占比明顯高于無效組，而年齡明顯低于無效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表1 兩組治療前后EBV-DNA拷貝量及治療前后拷貝量差值、比值比較[M(P25,P75)，lg(copy/mL)]

表2 兩組患者的臨床資料分析[M(P25,P75)/n(%)]

組別nTNM分期Ⅲ期Ⅳ期醫(yī)保類型省/市醫(yī)療保險(xiǎn)農(nóng)村合作醫(yī)療保險(xiǎn)商業(yè)保險(xiǎn)無有效組9528(29.47)67(70.53)34(35.79)43(45.26)15(15.79)3(3.16)無效組3614(38.89)22(61.11)12(33.33)15(41.67)8(22.22)1(2.78)Z/χ21.0620.798P0.3020.849

組別n化療方案TPTPF文化程度初中及以下中專/高中本科及以上有效組9551(53.68)44(46.32)18(18.95)64(67.37)13(13.68)無效組3617(47.22)19(52.78)9(25.00)21(58.33)6(16.67)Z/χ20.4360.952P0.5080.621

2.3兩組患者的實(shí)驗(yàn)室檢查資料及影像學(xué)檢查資料分析 有效組LDH水平及最大病灶最大徑均小于無效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4影響療效的Logistic回歸分析結(jié)果 以療效評(píng)價(jià)作為因變量，以單因素分析P<0.05的指標(biāo)作為自變量(具體賦值見表4)進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，治療前EBV-DNA拷貝量(OR=1.789，95%CI：1.033～3.189)及LDH水平(OR=1.024，95%CI：1.011～1.039)是影響療效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而治療前后EBV-DNA拷貝量比值(OR=0.775，95%CI：0.701～0.875)是影響療效的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表5。

表3 兩組患者的實(shí)驗(yàn)室檢查資料及影像學(xué)檢查資料分析[M(P25,P75)]

組別n實(shí)驗(yàn)室檢查資料FIB(mg/dL)D-D(μg/L)影像學(xué)檢查資料最大病灶最大徑(cm)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目(個(gè))有效組95372.14(343.84,402.55)235.21(204.97,264.96)3.15(1.86,4.11)2.18(1.29,2.69)無效組36391.34(360.89,406.42)250.59(213.96,282.97)3.72(2.85,4.77)2.38(1.67,3.17)Z1.4441.0782.0131.792P0.1490.2810.0440.094

表4 賦值表

2.5EBV-DNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果對(duì)NC患者化療療效的預(yù)測價(jià)值 根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果，將治療前EBV-DNA拷貝量、治療前后EBV-DNA拷貝量比值及LDH水平納入對(duì)晚期NC患者化療療效的預(yù)測價(jià)值ROC曲線分析指標(biāo)，結(jié)果顯示，治療前EBV-DNA拷貝量、治療前后EBV-DNA拷貝量比值及LDH水平對(duì)NC患者化療療效的預(yù)測均有一定價(jià)值(P<0.05)，見表6、圖1、表7；Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，治療前后EBV-DNA拷貝量比值及LDH水平對(duì)NC患者化療療效的預(yù)測效果明顯優(yōu)于治療前EBV-DNA拷貝量(Z=2.681、2.521，P=0.007、0.024)，但二者之間預(yù)測效果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.313，P=0.754)。

表5 影響療效的Logistic回歸分析結(jié)果

表6 NC患者化療療效預(yù)測ROC曲線數(shù)據(jù)比較

圖1 動(dòng)態(tài)監(jiān)測EBV-DNA對(duì)NC患者化療療效的預(yù)測價(jià)值

表7 動(dòng)態(tài)監(jiān)測EBV-DNA對(duì)NC患者化療療效的價(jià)值(%)

3 討 論

化療是針對(duì)晚期NC患者有效的治療手段之一，在國內(nèi)外多個(gè)指南中均推薦將此種方式聯(lián)合放療應(yīng)用于晚期NC患者的治療，均取得較好的療效[11-12]。PRAYONGRAT等[13]研究指出，治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的EBV-DNA動(dòng)態(tài)拷貝量與患者預(yù)后明顯相關(guān)，說明EBV-DNA與NC患者治療療效可能存在一定的相關(guān)性。目前，對(duì)于NC患者療效的判定依賴于PET-CT等影像學(xué)檢查，其價(jià)格高昂，會(huì)導(dǎo)致患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，對(duì)于普通NC患者的后續(xù)治療將產(chǎn)生不利影響[14-15]。

LDH是人體糖無氧酵解及糖異生的重要介質(zhì)，其可以充當(dāng)丙酮酸與L-乳酸之間的氧化還原反應(yīng)關(guān)鍵酶，同時(shí)參與α-酮酸的合成及代謝[16]。LONG等[17]研究指出，LDH的亞型LDH-5可影響瘤體的浸潤與轉(zhuǎn)移。本研究指出，LDH水平升高會(huì)導(dǎo)致療效明顯下降，主要原因有以下幾點(diǎn)：(1)LDH-5可以通過促進(jìn)病灶內(nèi)原癌基因激活的淋巴細(xì)胞向周圍擴(kuò)散，導(dǎo)致局部藥物濃度下降，從而降低療效[18]；(2)LDH-5還能促進(jìn)癌灶內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的分泌，造成瘤體血流相對(duì)豐富，從而導(dǎo)致血型播散的可能性加大；(3)LDH與缺氧誘導(dǎo)因子的分泌有密切關(guān)系，雖然目前機(jī)制尚未完全被發(fā)現(xiàn)，但缺氧誘導(dǎo)因子與LDH水平呈正相關(guān)。YEH等[19]研究中缺氧誘導(dǎo)因子是導(dǎo)致惡性腫瘤患者產(chǎn)生藥物抵抗的重要原因。本研究還得出了LDH水平對(duì)患者化療療效有較好的預(yù)測作用，但是靈敏度僅為45.94%，需要在今后的研究中開展聯(lián)合檢測以提升預(yù)測的靈敏度。

既往研究中EBV-DNA拷貝量均是原始數(shù)據(jù)[20]，由于部分患者拷貝量相對(duì)較大，可能會(huì)出現(xiàn)絕對(duì)值數(shù)較大而導(dǎo)致數(shù)據(jù)靈敏度下降，故本研究對(duì)EBV-DNA拷貝量取對(duì)數(shù)后進(jìn)行比較，使數(shù)據(jù)更加平穩(wěn)，降低范圍過大引起的靈敏度下降、數(shù)據(jù)共線性及異方差等問題。通過取對(duì)數(shù)后的拷貝量分析結(jié)果顯示，治療前EBV-DNA拷貝量、治療前后EBV-DNA拷貝量比值對(duì)NC患者化療療效均有一定預(yù)測價(jià)值，治療前后EBV-DNA拷貝量比值對(duì)預(yù)后的預(yù)測效果更好。采用EBV-DNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測價(jià)值與NC的關(guān)系在王勇利等[21]的研究中已經(jīng)得到了證實(shí)，其相對(duì)于單個(gè)時(shí)間點(diǎn)EBV-DNA拷貝量監(jiān)測具有更好的客觀性。NC患者EBV-DNA拷貝量與腫瘤負(fù)荷存在一定關(guān)系，但部分患者由于個(gè)體原因造成對(duì)化療不敏感而導(dǎo)致病灶未得到有效緩解，從而可能出現(xiàn)治療前EBV-DNA拷貝量較高的患者由于敏感程度較高，治療后該指標(biāo)下降較明顯，而部分治療前該值較低的患者，可能出現(xiàn)治療后緩解不明顯導(dǎo)致該指標(biāo)較高的情況。雖然既往有研究指出治療前后EBV-DNA拷貝量與患者治療療效均有一定相關(guān)性[22-23]，但受上述因素的影響會(huì)導(dǎo)致預(yù)測出現(xiàn)偏差。加之治療前EBV-DNA拷貝量對(duì)治療后的拷貝量也存在明顯影響，單純使用某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的拷貝量可能會(huì)受其他因素的干擾而導(dǎo)致預(yù)測不準(zhǔn)確。通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測并計(jì)算治療前后EBV-DNA拷貝量比值，能較好地反映治療前后EBV-DNA拷貝量的改變情況，同時(shí)有效排除基線指標(biāo)對(duì)治療中相關(guān)指標(biāo)的影響，故對(duì)于療效有更好的預(yù)測價(jià)值。

本研究為單中心小樣本研究，同時(shí)由于時(shí)間及實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)限制，對(duì)于患者EBV-DNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)相對(duì)有限，故結(jié)果可能存在偏倚；EBV-DNA拷貝量動(dòng)態(tài)監(jiān)測指標(biāo)預(yù)測NC患者化療療效的靈敏度僅為53.22%，還有進(jìn)一步提升的空間。但本研究對(duì)EBV-DNA拷貝量動(dòng)態(tài)監(jiān)測指標(biāo)與NC患者化療療效之間的相關(guān)性結(jié)果是肯定的，這能為今后臨床工作中對(duì)提升NC患者治療后療效評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性提供參考，同時(shí)也會(huì)在今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本年齡、疾病分期等影響療效指標(biāo)的取樣范圍，對(duì)本結(jié)果進(jìn)行深入驗(yàn)證。

綜上所述，EBV-DNA拷貝量動(dòng)態(tài)監(jiān)測指標(biāo)對(duì)晚期NC患者化療療效有較好的預(yù)測價(jià)值，可以將其納入評(píng)價(jià)NC患者化療的體系中。