miR-181通過調(diào)控TGFBR1表達(dá)抑制顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換*

王如科，孫源源，李克芬，李一帆，于國淵△

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河北邯鄲 056001 ；2 河北省邯鄲市第一醫(yī)院影像科，河北邯鄲 056001

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(IA)是腦動(dòng)脈主要分叉的病理性擴(kuò)張，是一種常見的腦血管疾病，急性病死率約為50%[1-2]。3%～5%的成年人患有未破裂的IA[3]。IA發(fā)生和破裂的機(jī)制仍不清楚，IA的病因可能與血流對血管壁的剪切力應(yīng)激、炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等因素有關(guān)。炎癥級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)后大量炎癥因子和氧化因子被釋放，會(huì)導(dǎo)致許多病理過程，包括中膜彈力層中斷、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等[4-5]。當(dāng)血管壁退化時(shí)，顱內(nèi)動(dòng)脈變得太薄弱，無法抵抗血液動(dòng)態(tài)力，腦動(dòng)脈管壁發(fā)生囊狀擴(kuò)張。VSMC是血管壁中主要的細(xì)胞類型，VSMC有兩種表型：收縮型和合成型[6]。在炎癥和氧化應(yīng)激等病理刺激下，收縮型VSMC可以轉(zhuǎn)換為合成型[7]。VSMC表型轉(zhuǎn)換在幾種心血管疾病中發(fā)揮重要作用[8]。microRNAs (miRNAs)是一種短鏈單鏈非編碼RNA，廣泛參與許多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，在調(diào)控各種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[9]。miRNAs除參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展外，也參與IA的發(fā)生和發(fā)展。有研究報(bào)道，miR-370-3p通過靶向IA中的KDR/AKT信號通路抑制平滑肌細(xì)胞增殖[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，VSMC中miR-181的異常表達(dá)可能與動(dòng)脈粥樣硬化和腦血管疾病的發(fā)生相關(guān)[11-12]。例如，在VSMC中血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)降低了miR-181的表達(dá)水平，過表達(dá)miR-181抑制了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的合成表型基因骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)和平滑肌細(xì)胞與膠原的黏附[13]，提示miR-181可能通過調(diào)節(jié)OPN介導(dǎo)的VSMC功能，參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程。本研究旨在探究IA中miR-181在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用，采用TargetScan預(yù)測其靶蛋白并驗(yàn)證其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本收集 收集邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科2016年11月至2019年5月確診為IA并進(jìn)行手術(shù)的患者80例，并收集同期健康體檢中心年齡、性別匹配無IA家族史的健康對照者80例作為研究對象。手術(shù)中取出的IA組織在液氮中快速冷凍。收集接受開顱治療的創(chuàng)傷患者的正常顳淺動(dòng)脈。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2主要材料 Trizol試劑購自美國Thermo公司，TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自美國 Biotuim 公司。miR-181模擬物(miR-181 mimics)由上海吉?jiǎng)P基因公司合成，人腦VSMC購自美國ScienCell公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo公司。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、平滑肌22α蛋白(SM22α)、β-actin抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。OPN、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體均購自美國Abcam公司。轉(zhuǎn)化生長因子β受體1(TGFBR1)的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)熒光素酶報(bào)告基因載體[TGFBR1野生型(wt)及突變型(mut)]由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購自美國Mllipore公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) IA患者和健康對照者均抽取空腹肘靜脈血約5 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心5 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存。標(biāo)本收集完畢后，向200 μL上清液中加入1 mL Trizol裂解液吹打混勻后室溫裂解5 min。每管中加入200 μL氯仿，室溫放置15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min。吸取上清液加入等體積異丙醇，室溫放置10 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄掉上清液，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)重懸沉淀，8 000 r/min，4 ℃離心5 min，晾干沉淀。用去離子水溶解RNA。

將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到模板單鏈cDNA，然后采用 qPCR試劑盒對cDNA 進(jìn)行qPCR。按照試劑盒說明書配制20 μL體系，收集熒光信號。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。Ct值為熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-181的相對表達(dá)水平。miR-181引物F:GCGAACATTCATTGCTGTCG；R:GCAC TGGATACGACACCCAC。用U6作為內(nèi)參，U6引物F:GCGCGTCGTGAAGCGTTCT；R：CACTGGA TACGACAAATATG。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 人腦VSMC快速復(fù)蘇后，800 r/min離心5 min，棄掉凍存液，采用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔1×105個(gè)接種到6孔培養(yǎng)板中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人腦VSMC呈對數(shù)生長期時(shí)，采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，PBS沖洗3次，采用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸制成單個(gè)細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔1×105個(gè)鋪至6孔板中，分為miR-181 mimics和NC mimics，細(xì)胞貼壁18～24 h后，按照Lipofectamine 2000說明書將miR-181 mimics和NC mimics分別與無血清培養(yǎng)基混勻后加入各組待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6Western bolt 收集轉(zhuǎn)染完成的細(xì)胞，每孔中加入100 μL蛋白裂解液，在冰上裂解20 min。加入適量上樣緩沖液，以100 ℃水浴煮沸5 min使蛋白變性。按照50 μg總蛋白加入上樣孔進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜封閉完成后，在4 ℃冰箱孵育一抗過夜，第2天洗膜后孵育相應(yīng)的二抗，洗膜后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法。條帶用Image J進(jìn)行灰度值半定量計(jì)算，采用β-actin作為內(nèi)參，分析各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 取對數(shù)生長期的人腦VSMC，接種于24孔板中(每孔細(xì)胞2×104個(gè))，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)將TGFBR1的3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體及NC mimics導(dǎo)入細(xì)胞，分為4組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔：miR-181 mimics+TGFBR1-wt共轉(zhuǎn)染組；miR-181 mimics+TGFBR1-mut共轉(zhuǎn)染組；NC mimics+TGFBR1-wt共轉(zhuǎn)染組；NC mimics+TGFBR1-mut共轉(zhuǎn)染組。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗2次后，加入100 μL 1×被動(dòng)裂解液，孵育15 min后每孔吸取20 μL上清液加入96孔發(fā)光檢測板中，放入發(fā)光檢測儀中讀數(shù)，數(shù)據(jù)用GrahPad Prism 8進(jìn)行作圖與分析。

2 結(jié) 果

2.1IA患者和健康對照者血清miR-181表達(dá)水平比較 采用qPCR檢測IA患者和健康對照者血清miR-181表達(dá)水平，結(jié)果顯示，IA患者血清miR-181表達(dá)水平與健康對照者比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 IA患者和健康對照者血清miR-181表達(dá)水平

2.2miR-181抑制VSMC表型轉(zhuǎn)換 人腦VSMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181 mimics和miR-181抑制劑(miR-181 inhibitor)后采用Western bolt檢測VSMC收縮表型基因SMA和SM22α及合成表型基因OPN的表達(dá)水平，以及其分泌的MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181 mimics升高了SMA和SM22α的表達(dá)水平，降低了OPN的表達(dá)水平，同時(shí)MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平也降低。轉(zhuǎn)染miR-181 inhibitor降低了SMA和SM22α的表達(dá)水平，上調(diào)了OPN的表達(dá)水平，同時(shí)MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平也上調(diào)。見圖2。

圖2 miR-181對腦動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換的影響

2.3TGFBR1是miR-181的直接靶點(diǎn) TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-181與TGFBR1的3′-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)，miR-181可能通過靶向調(diào)控TGFBR1的表達(dá)水平而發(fā)揮作用。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，TGFBR1-wt與miR-181 mimics共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而TGFBR1-mut各組間熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖3B。

注：A為TargetScan軟件預(yù)測TGFBR1是miR-181的靶基因；B為雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果，與NC mimics比較，*P<0.05。

2.4IA組織中TGFBR1蛋白表達(dá)水平 采用Western blot檢測IA患者手術(shù)切除的IA組織中TGFBR1蛋白表達(dá)水平，并采用接受開顱治療的創(chuàng)傷患者的正常顳淺動(dòng)脈作為對照。結(jié)果顯示，與對照者比較，IA患者IA組織標(biāo)本中TGFBR1蛋白表達(dá)水平升高，見圖4。

圖4 IA組織中TGFBR1表達(dá)水平

2.5miR-181靶向調(diào)控TGFBR1的蛋白表達(dá)水平 Western blot分析表明，轉(zhuǎn)染miR-181 mimics降低了TGFBR1的蛋白表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染miR-181 inhibitor升高TGFBR1的蛋白表達(dá)水平。見圖5。

圖5 miR-181靶向調(diào)控TGFBR1的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

雖然IA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但氧化應(yīng)激、炎癥、血流動(dòng)力學(xué)失調(diào)和細(xì)胞外基質(zhì)降解均有助于IA的形成和發(fā)展。VSMC表型轉(zhuǎn)換在IA、動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈瘤等疾病中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miR-181通過調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[11]。有研究表明，VSMC表型調(diào)控與IA的形成、生長和破裂相關(guān)[14-15]。VSMC由收縮型轉(zhuǎn)換為合成型，合成型VSMC刺激促炎過程、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)IA的形成和破裂。本研究結(jié)果顯示，IA患者血清miR-181表達(dá)水平低于健康對照者。為了探究IA中miR-181對VSMC表型轉(zhuǎn)換的作用，采用miR-181 mimics和miR-181 inhibitor轉(zhuǎn)染人腦VSMC檢測收縮表型的標(biāo)記SMA、SM22α及 OPN的表達(dá)水平，結(jié)果表明，VSMC過表達(dá)miR-181基因細(xì)胞SMA、SM22α表達(dá)水平升高，OPN表達(dá)水平降低。同時(shí)抑制miR-181表達(dá)水平后SMA、SM22α表達(dá)水平降低，OPN表達(dá)水平升高。VSMC合成表型與收縮基因的表達(dá)降低有關(guān)，雖然VSMC失去了收縮能力，但有助于招募促炎細(xì)胞和血管壁細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。本研究結(jié)果提示，抑制miR-181基因VSMC MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均升高。

miRNA可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA的降解和翻譯。miRNA與其靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)，通過切斷靶基因的mRNA分子和(或)抑制靶基因的翻譯來發(fā)揮作用。幾個(gè)miRNA可以共同調(diào)控某一基因的表達(dá)[16]。TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果表明，TGFBR1為miR-181的靶向調(diào)控基因。TGFBR1是一種特異性TGF-β受體，介導(dǎo)TGF-β的生理和病理功能，已有文獻(xiàn)證明TGFBR1是動(dòng)脈粥樣硬化過程的主要成分[17]。TGFBR1在TGF-β介導(dǎo)的心血管疾病涉及的幾乎所有細(xì)胞類型中均起作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC、肌成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[18]。本研究采用Western blot檢測了IA患者手術(shù)切除的IA組織中TGFBR1的蛋白表達(dá)水平，并用接受開顱治療的創(chuàng)傷患者的正常顳淺動(dòng)脈作為對照，結(jié)果顯示，與對照者比較，IA組織中TGFBR1的蛋白表達(dá)水平升高。因此猜測，在IA中miR-181通過調(diào)控TGFBR1的蛋白表達(dá)水平調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換。

為了研究miR-181與TGFBR1的靶向調(diào)控關(guān)系，本研究采用TargetScan軟件預(yù)測及熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證上述猜測。結(jié)果表明，TGFBR1是miR-181直接調(diào)控的靶基因。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-181后TGFBR1的蛋白表達(dá)水平降低；而抑制miR-181后TGFBR1的蛋白表達(dá)水平升高。

綜上所述，IA患者血清中miR-181表達(dá)水平下降，過表達(dá)miR-181抑制VSMC收縮表型向合成型表型轉(zhuǎn)換。miR-181直接靶點(diǎn)是TGFBR1，IA組織中TGFBR1的蛋白表達(dá)水平升高。因此，IA中miR-181可能通過調(diào)控TGFBR1的蛋白表達(dá)水平抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)換，這為治療IA及控制蛛網(wǎng)膜下腔出血提供了新的靶點(diǎn)。