BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制探討*

王 林，段雯婷，王 維

1.陜西省西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710002；2.陜西省西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西西安 710002；3.陜西省西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710003

骨是包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的常見部位，幾乎所有晚期乳腺癌患者均會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[1-3]。骨轉(zhuǎn)移常表現(xiàn)為溶骨性病變，導(dǎo)致病理性骨折、頑固性骨痛、神經(jīng)壓迫和高鈣血癥[4]。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，為乳腺癌細(xì)胞的生長提供了良好的微環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs與乳腺癌細(xì)胞(BCCs)的相互作用是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和骨溶解的重要環(huán)節(jié)[5]，深入了解這種相互作用及潛在的機(jī)制有助于探究乳腺癌的治療新策略。骨中存在多種生長因子，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、血小板源性生長因子和胰島素樣生長因子[6]，這些因子也被稱為骨儲(chǔ)存生長因子或骨衍生生長因子，其中TGF-β的促乳腺癌骨轉(zhuǎn)移作用已經(jīng)明確。TGF-β通過Smad信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)的分泌。PTHrP通過上調(diào)破骨細(xì)胞激活因子促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨質(zhì)破壞[7]。但是,對(duì)于其他骨生長因子的功能和分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。BMP9是一種骨儲(chǔ)存生長因子，被證實(shí)為骨形成過程中最有效的BMP[8-9]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMP9能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]，然而BMP9對(duì)骨微環(huán)境中的乳腺癌細(xì)胞的作用尚不明確。本研究體外模擬腫瘤微環(huán)境，在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)HS-5細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入BMP9，研究BMP9如何調(diào)節(jié)BMSCs和BCCs的相互作用，以探索乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5購于美國菌種保藏中心，均由西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。

1.2儀器與試劑 重組BMP9購于Abcam生物試劑有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白緩沖液和封閉蛋白購于武漢博士德生物工程有限公司；蛋白marker購于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室和辣根過氧化物酶(HRP)發(fā)光試劑購于Millipore公司；Matrigel膠購于Sigma公司；兔抗人趨化因子受體4(CXCR4)抗體購于Abcam 公司；兔抗人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)抗體購于Santa Cruz公司；兔抗人P-Akt、Akt抗體購于Cell Signaling Technology公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9、MMP2抗體購于Immunoway公司；山羊抗兔IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞和HS-5細(xì)胞用含10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃,50 mL/L CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2共培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 取常規(guī)培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞和HS-5細(xì)胞，分別以1.5×105/孔和1×105/孔細(xì)胞數(shù)量接種于6孔板中和Transwell小室中在37 ℃,50 mL/L CO2中進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)16 h后，兩種細(xì)胞更換為DMEM無血清培養(yǎng)基，并將小室置于6孔板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)照組在共培養(yǎng)體系中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，實(shí)驗(yàn)組給予100 ng/mL BMP9蛋白處理。

1.3.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 接種MDA-MB-231細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞共培養(yǎng)前，用100 μL移液器槍頭垂直劃痕，并記錄0 h劃痕寬度，然后將MDA-MB-231細(xì)胞與HS-5細(xì)胞疊放進(jìn)行共培養(yǎng)，顯微鏡觀察36 h同一視野劃痕愈合情況，計(jì)算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，以此反映細(xì)胞遷移能力的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 預(yù)先在每孔Transwell細(xì)胞上室加入50 μL Matrigel膠(DMEM無血清培養(yǎng)基1∶8稀釋)，37 ℃ 30 min待凝固。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心后，分別用各自共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液重懸，以5×104/孔的濃度取400 μL加入上室，下室分別加入600 μL各自共培養(yǎng)體液的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室用PBS清洗2遍，自然晾干后經(jīng)結(jié)晶紫染色5 min，于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以反映細(xì)胞侵襲能力的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5Western blot檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞MMP2、MMP9、CXCR4、SDF-1、P-Akt及HS-5細(xì)胞SDF-1表達(dá)的影響 按試劑盒要求分別提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞和HS-5細(xì)胞總蛋白，取120 μg總蛋白行10% SDS-PAGE進(jìn)行分離后干轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，經(jīng)三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(TBST)(含50 g/L脫脂奶粉)4 ℃封閉4 h后，分別加入經(jīng)1∶1 000稀釋的兔抗人MMP9、MMP2、CXCR4、SDF-1、P-Akt抗體(MDA-MB-231細(xì)胞)，兔抗人SDF-1抗體(HS-5細(xì)胞)，于4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌2次和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液洗滌1次；加入經(jīng)1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h,重復(fù)洗滌；暗室滴加HRP發(fā)光試劑2 min后經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Quantity One 4.6.6軟件進(jìn)行各條帶灰度值分析，并用內(nèi)參作比值，以檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6明膠酶譜法檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞MMP2、MMP9相對(duì)活性的影響 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞上清液，經(jīng)2 000 r/min離心10 min備用，配置分離膠和濃縮膠，根據(jù)蛋白水平調(diào)整上樣量，與5×緩沖液混合上樣，于4 ℃行SDS-PAGE，將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，每次40 min，漂洗液漂洗2次,每次40 min，然后將凝膠置于孵育液于37 ℃ 孵育42 h，孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色3 h，以及脫色液A、B、C分別脫色0.5、1.0、2.0 h，用Quantity One 4.6.6軟件分析藍(lán)色背景MMP2(相對(duì)分子質(zhì)量72×103)、MMP9(相對(duì)分子質(zhì)量92×103)透亮帶寬度和灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1BMP9可抑制共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞的遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞平均愈合率分別為(84.28±2.54)%、(44.49±4.86)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.58，P<0.05)。見圖1。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響(×100)

2.2BMP9可抑制共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為481±22、121±11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.96，P<0.05)。見圖2。

2.3BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞MMP9、MMP2表達(dá)及相對(duì)活性的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MMP9的蛋白表達(dá)(0.10±0.01)較對(duì)照組(0.79±0.03)明顯下調(diào)，MMP2的蛋白表達(dá)(0.11±0.03)較對(duì)照組(0.82±0.05)也明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=34.99、19.04，P<0.05)，見圖3；明膠酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MMP9相對(duì)活性(0.14±0.03)較對(duì)照組(0.90±0.07)明顯下調(diào)，MMP2相對(duì)活性(0.12±0.02)較對(duì)照組(1.04±0.14)也明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.24、11.15，P< 0.05)，見圖4 。

圖2 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響(×200)

圖4 明膠酶譜法檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞MMP9、MMP2相對(duì)活性的影響

2.4BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞及HS-5細(xì)胞SDF-1/CXCR4-PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞中CXCR4受體蛋白表達(dá)(0.08±0.01)與對(duì)照組(0.07±0.01)比較，其配體SDF-1的蛋白表達(dá)(0.06±0.02)與對(duì)照組(0.05±0.01)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.00、0.80，P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組P-Akt蛋白表達(dá)(0.09±0.01)較對(duì)照組(0.48±0.07)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.68，P<0.05)；而實(shí)驗(yàn)組Akt蛋白表達(dá)(0.40±0.05)與對(duì)照組(0.46±0.03)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.70，P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組HS-5細(xì)胞中SDF-1蛋白表達(dá)(0.14±0.01)較對(duì)照組(0.42±0.06)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.93，P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系中MDA-MB-231細(xì)胞及HS-5細(xì)胞SDF-1/CXCR4-PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響

3 討 論

腫瘤包括乳腺癌在內(nèi)，不是以自我維持的實(shí)體方式存在，而是不斷地與其微環(huán)境相互作用[11-12]。BMSCs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，不管是在原發(fā)性癌還是骨轉(zhuǎn)移性癌中均可與BCCs發(fā)生相互作用。BCCs可在乳腺癌早期招募BMSCs至其原發(fā)部位[5]。越來越多的證據(jù)表明，BMSCs與BCCs的相互作用在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色[13-14]，另外二者的交互對(duì)乳腺癌晚期所致的骨骼損傷過程有促進(jìn)作用[15]。因此，腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的相互作用可能是治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。

BMP9也被稱之為生長分化因子2，與包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的生長、黏附、侵襲和遷移有關(guān)。BMP9可通過BMP/SMAD途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長[16]，也可通過非經(jīng)典BMP/SMAD途徑抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長及促進(jìn)其凋亡[17]。有研究表明，BMP9可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲[9]。BMP9是最有效的成骨因子，可能比目前臨床上使用的其他BMP有更好的促進(jìn)骨再生的作用[8-9]。另外，作為一種分泌性蛋白，BMP9是骨髓中重要的骨相關(guān)分子，然而，其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。有研究結(jié)果顯示，BMP9通過阻斷Akt信號(hào)通路降低HS-5細(xì)胞的細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基的分泌，進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲[9]。

本研究建立HS-5細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)模型，體外模擬腫瘤微環(huán)境，研究BMP9如何調(diào)節(jié)BMSCs與BCCs的相互作用。BMP9對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲有明顯抑制作用。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白SDF-1和MMPs表達(dá)明顯減少，然而，BMP9調(diào)控這些轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。不同癌癥對(duì)BMP9的反應(yīng)不同，有文獻(xiàn)報(bào)道BMP9在卵巢癌中與本研究相反的作用[16]。BMP9的致瘤或抑瘤特性反映了其在該腫瘤發(fā)育過程中與BCCs復(fù)雜的相互作用過程，BCCs對(duì)BMP9的生物學(xué)反應(yīng)亦取決于其劑量、細(xì)胞類型和腫瘤微環(huán)境，以及其他尚未確定的因素。SDF-1又稱為CXCL12，在HS-5細(xì)胞中呈高度表達(dá)，而其受體CXCR4在MDA-MB-231細(xì)胞中呈高度表達(dá)。本課題進(jìn)一步研究BMP9對(duì)共培養(yǎng)體系SDF-1/CXCR4軸的影響，結(jié)果表明，BMP9降低了HS-5細(xì)胞中SDF-1的分泌，而對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)無影響，同時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞下游信號(hào)分子P-Akt表達(dá)降低。

綜上所述，BMP9可抑制體外模擬腫瘤微環(huán)境的共培養(yǎng)體系中乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用可能是通過調(diào)節(jié)共培養(yǎng)體系中SDF-1/CXCR4-PI3K信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，為乳腺癌的生物治療提供了新的靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，下一步課題組將進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)研究來進(jìn)一步證實(shí)其推斷。