金黃色葡萄球菌SaeRS二元調控系統促進細菌凝集和生物被膜形成*

胡劉平，劉 倩

1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 310115；2.上海交通大學附屬第六人民醫院檢驗科，上海 201306

金黃色葡萄球菌是一種可以引起人類和動物多種感染性疾病的革蘭陽性菌，其致病性與細菌的凝集反應和生物被膜形成密切相關，細菌通過復雜的調控系統調節這些參與細菌凝集和生物被膜形成的毒力因子表達。據報道，金黃色葡萄球菌ArlRS二元調控系統調節ebh基因轉錄表達，抑制葡萄球菌表面蛋白表達，促進凝集[1]。SaeRS二元調控系統在細菌致病過程中發揮重要作用[2-4]。目前，關于SaeRS調控細菌生物被膜的分子機制尚有爭議，在不同菌株中調控方式不同[5-8]。有研究發現，Newman(NM)菌株中由于SaeS第一個跨膜區點突變(L18P)導致其調控網絡發生改變，從而影響細胞外黏附蛋白eap表達，促進細菌凝集，但在USA300菌株中并未發生這種變化[9]，提示金黃色葡萄球菌不同菌株調控方式不同。本研究通過外源性加入人血漿蛋白，探討不同金黃色葡萄球菌菌株的SaeRS在人血漿蛋白促進細菌凝集和生物被膜形成中的作用。有研究發現，人血漿蛋白通過促進SaeRS調控靶基因的表達，促進金黃色葡萄球菌的凝集和生物被膜形成[10]；SaeRS突變影響其調控方式，如在USA300菌株中，人血漿蛋白促進凝固酶coa的高表達促進細菌凝集；在NM菌株中，由于SaeS點突變，人血漿蛋白調控細菌凝集機制存在差異。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 USA300、NM、ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72、NMΔcoa、USA300Δcoa、NMΔeap和USA300Δeap。

1.1.2人血漿蛋白制備 收集10例健康體檢人員的靜脈抗凝(枸櫞酸鈉)血，男、女各5例，平均年齡29.9歲。排除標準：(1)患有全身性疾病和感染；(2)血紅蛋白水平低于110 g/L；(3)血小板計數低于150×109/L；(4)有吸煙習慣和在采血前5 d內服用非甾體抗炎藥物。收集每例健康體檢人員2.7 mL靜脈血，每管含有0.3 mL枸櫞酸鈉溶液作為抗凝血劑。460×g離心8 min，乏血小板血漿(PPP)、富血小板血漿(PRP)、濃縮紅細胞分層[10]。在無菌條件下，每管PPP約0.3 mL，位于分層溶液的頂部被抽吸。然后小心地收集位于紅細胞顆粒上的類似體積的PRP，以避免白細胞混入。PRP中血小板計數為285(183,386)×109/L;PPP中血小板計數為6(4,7)×109/L。血小板檢測采用Sysmex XN2800全自動血細胞分析儀。

1.2儀器與試劑 Molecular Devices SpectraMax250酶標儀；ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈反應儀；氣浴恒溫振蕩器(SHZ-82)；胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)；RNeasy Mini Kit RNA 抽提試劑盒；Reverse Transcription Kit試劑盒。

1.3生物被膜形成與測定 所用培養基為TSB(30 g/L)添加0.5%葡萄糖注射液。接種前預先在96孔板微滴板上加入200 μL 20%的健康人PPP，并在4 ℃下孵育過夜。棄上清液加入200 μL新配置的菌懸液后，蓋上蓋子，于37 ℃條件下恒溫恒濕培養24 h，棄去96孔板中的培養物，用200 μL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.3)沖洗3次，去除培養基和浮游狀態的細菌。在96孔板中每個孔加入乙醇200 μL加蓋靜置15 min，吸除乙醇后在30 ℃環境下自然風干，固定生物膜。然后在每個孔中加入1滴1%結晶紫溶液，靜置染色30 min后棄去染色液，用水沖洗直至無色，晾干。在染色的孔中加入200 μL 5%冰乙酸溶液，以200 μL 5%冰乙酸溶液作為空白孔，測定各個檢測孔590 nm波長的吸光度值(A值)。

1.4細菌凝集實驗 挑取血平板上單個菌落于3 mL TSB 培養基中振蕩培養過夜，然后吸取80 μL 菌液加入到8 mL TSB培養基中繼續振蕩培養4 h，PBS洗滌3次后配置成A值為1.0的菌懸液2管，其中一管加入2.5%的PPP，室溫靜置培養2 h，每隔15 min吸取上清液檢測A600值直至2 h。

1.5反轉錄-聚合酶鏈反應 分別收集NM和USA300及其敲除sae 菌株對數生長期(2 h)的菌落，加入磁珠管內用破碎機振蕩2次(頻率：1 600次/分)進行金黃色葡萄球菌破壁，然后用RNeasy Mini Kit RNA抽提試劑盒提取RNA。利用IDT在線軟件根據已發表的金黃色葡萄球菌序列設計emp、eap、clfb、coa、gyrb引物，寡核苷酸引物序列見表1。取1 μg RNA配成7 μL體系用HifairTMⅢ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)進行反轉錄得到cDNA；然后取2.5 μL cDNA加入22.5 μL[引物+SYBR Green Master(ROX)+H2O]體系中，采用ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈反應儀進行擴增，條件如下：50 ℃ 2 min，94 ℃ 15 min，40個循環(94 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 32 s)，繪制解離曲線(95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s)。所有標本均重復3次，以gyrb作為參考基因。

表1 引物序列

1.6統計學處理 采用GraphPad Prism5軟件分析實驗結果并繪制圖表。組間差異采用單因素方差分析進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1金黃色葡萄球菌凝集和生物被膜形成檢測 首先通過外源性加入人血漿蛋白，體外檢測細菌凝集和生物被膜的形成。收集目前金黃色葡萄球菌臨床感染不同ST分型的臨床分離株(ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72)和2株實驗室菌株UAS300和NM。加入PPP血漿蛋白進行檢測，結果顯示，在培養細菌中加入PPP，所有檢測的金黃色葡萄球菌菌株相對于PBS對照組，均表現出更強的凝集效應。PPP促進不同菌株的凝集表型有差異，PPP促進NM菌株凝集能力最強，而ST398 09-1059凝集能力最弱(圖1A)，提示人血漿蛋白可以促進金黃色葡萄球菌的凝集發生，但不同臨床分離菌株中存在差異。細菌凝集和生物被膜的形成密切相關，本研究進一步在人血漿蛋白中搭建了觀察金黃色葡萄球菌的生物被膜形成的檢測體系顯示，無論是在培養基中加入PRP或PPP，所有檢測的金黃色葡萄球菌體外生物被膜形成能力均明顯增強(圖1B)，提示人血漿蛋白促進金黃色葡萄球菌生物被膜形成具有廣譜性。

注：A為金黃色葡萄球菌不同臨床菌株在PBS和PPP中的凝集表型比較，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌不同臨床菌株在PRP和PPP培養基中的生物膜結果，*P<0.05。

2.2人血漿蛋白通過調控SaeRS二元調控系統促進細菌凝集和生物被膜形成 本研究分別向NM和USA300菌株的PBS培養基中加入PPP，在PPP組這兩種菌株均出現了凝集效應，NM菌株的凝集效果明顯強于USA300菌株。在NM和USA300菌株中引入sae基因突變后，對應的凝集效應均明顯降低。結果顯示，sae的存在能夠明顯影響金黃色葡萄球菌的凝集能力(圖2A)。進一步通過體外生物被膜研究發現，人血漿蛋白不能促進NMΔsae或者是USA300Δsae敲除菌株的生物被膜形成(圖2B)。為了進一步證實SaeRS調控細菌凝集過程，本研究在NMΔsae菌株中分別回補SaeRS和SaeRS L18P的表達，構建了互補菌株NMpSaeRS和NMpSaeRS L18P。本研究顯示，SaeRS和SaeRS L18P菌株在人血漿蛋白中均可回復sae敲除菌株細菌凝集活性，并且回復活化狀態的SaeRS L18P的菌株，其凝集活性明顯強于pSaeRS(圖3)，進一步證實人血漿蛋白通過調控SaeRS二元調控系統影響細菌凝集，NM菌株中SaeRS系統的高度活化導致NM菌株的高度凝集狀態。

注：A為金黃色葡萄球菌(USA300和NM)sae 敲除菌株的凝集表型比較，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌(USA300和NM)sae敲除菌株的生物膜結果，*P<0.05。

注：*P<0.05。

2.3人血漿蛋白調控coa和eap敲除菌株凝集檢測 為了探討在不同菌株中人血漿蛋白調控SaeRS系統的分子機制，本研究分別構建了SaeRS系統調控的靶基因coa和eap敲除菌株并檢測其凝集活性，研究發現，PPP可以促進NMΔcoa敲除菌株的凝集活性，但不能促進USA300Δcoa敲除菌株的凝集活性，PPP仍然可以促進NMΔeap和USA300Δeap敲除菌株的凝集活性，見圖4A、4B。

注：A為金黃色葡萄球菌(NM和USA300)coa和eap敲除菌株在觀察終點(2 h)的凝集結果，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌(NM和USA300) coa敲除菌株的生物膜結果，*P<0.05。

2.4金黃色葡萄球菌在人血漿蛋白作用時不同基因轉錄表達水平 USA300菌株SaeRS可能通過調控靶基因coa的表達發揮功能，但是NM菌株中SaeRS靶基因coa和eap敲除后均不影響人血漿蛋白對細菌凝集表型的影響。為了進一步探討人血漿蛋白調控細菌凝集的分子機制，本研究進一步檢測了人血漿蛋白作用下USA300和NM菌株中SaeRS調控靶基因的表達水平，結果表明，USA300菌株中人血漿蛋白明顯促進coa基因的轉錄表達，而在NM菌株中人血漿蛋白作用下，SaeRS調控的多個靶基因(coa、eap、clfb、emp)的轉錄表達水平均明顯增強。見圖5。

注：*P<0.05。

3 討 論

金黃色葡萄球菌可以利用宿主血漿蛋白促進自身凝集，本研究發現,人血漿蛋白可促進金黃色葡萄球菌不同來源的臨床分離菌株的凝集及生物被膜形成，但是不同臨床分離菌株對人血漿蛋白的效果不同。據報道，NM菌株中SaeRS L18P點突變使其處于高度活化狀態[11-13]。本研究發現，人血漿蛋白促進NM菌株凝集活性最強，推測是否是因為SaeRS二元調控系統高度活化導致的這種現象，進一步分別以USA300和NM 為背景構建sae敲除菌株發現，在NM和USA300菌株中引入sae基因突變后，對應的凝集效應和生物被膜形成能力均明顯降低，提示SaeRS二元調控系統在人血漿蛋白促進細菌凝集和生物被膜形成過程中發揮重要作用。

據報道，金黃色葡萄球菌SaeRS調控系統的靶基因coa可促進細菌凝集[14]。NM菌株中三磷酸腺苷依賴蛋白酶FtsH通過促進SaeRS靶基因eap的高表達促進細菌凝集[9]。本研究發現，SaeRS二元調控系統在不同菌株中通過調控靶基因的轉錄表達，從而影響細菌凝集和生物被膜形成。在USA300菌株中人血漿蛋白主要通過調控SaeRS調控因子coa的表達促進細菌凝集，但在NM菌株中人血漿蛋白調控SaeRS下游eap的表達并不是促進細菌凝集的唯一機制，人血漿蛋白可能通過調控SaeRS下游多個靶基因的表達協同作用而促進細菌凝集。

細菌的凝集反應和生物被膜形成與金黃色葡萄球菌的致病性密切相關[15-16]，但SaeRS調控細菌生物被膜的分子機制尚有爭議。PAHARIK等[17]研究發現,SaeRS通過促進核酸酶表達降解細菌DNA抑制生物被膜形成。本研究通過對不同臨床分離菌株研究發現，人血漿蛋白通過SaeRS二元調控系統調節細菌凝集和生物被膜形成。本研究利用人血漿蛋白成功建立了用于檢測金黃色葡萄球菌的凝集活性和生物被膜形成的體系，具體通過檢測A值及相應百分比進行量化。本研究分別采用兩種不同的血漿蛋白進行作用，結果表明，人血漿蛋白促進金黃色葡萄球菌凝集發生和生物被膜的形成具有廣譜性，并且與血漿中血小板無關，提示主要是因為人纖維蛋白原在這個過程中發揮功能。進一步研究發現，由于SaeRS二元調控系統活性變化會導致人血漿蛋白調控機制發生改變。NM菌株中SaeS的點突變導致SaeRS系統呈高活化狀態時，人血漿蛋白調控機制發生變化，提示毒力調控蛋白單個氨基酸改變可以導致整個調控網絡的變化。

據報道，凝固酶通過降解宿主纖維蛋白原轉變為纖維蛋白促進細菌凝集和生物被膜形成[18]。本研究發現，NM菌株中SaeRS對coa的調控并不是其唯一的調控機制，一方面提示細菌中還有其他毒力因子參與宿主蛋白相互作用；另一方面提示宿主其他一些未知血漿蛋白也參與細菌的凝集過程。后期需要通過構建可能參與凝集的細菌毒力因子多敲除菌株進一步探尋細菌與宿主相互作用的主要分子，為治療金黃色葡萄球菌感染提供新的藥物靶標及理論依據。