丹紫康膝沖劑延緩膝骨關節炎模型大鼠軟骨退變及軟骨下骨異常骨重建的作用機制研究※

何 花 董大立

(湖南中醫藥大學第二附屬醫院護理部，湖南 長沙 410005)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關節軟骨退變為主要特征，并逐漸侵犯軟骨下骨、滑膜等周圍組織的慢性、進展性關節疾病[1]。對于KOA的治療除了延緩關節軟骨退變外，還需要關注軟骨下骨硬化、囊性變和代償性骨贅形成等異常骨重建的影響[2]。KOA屬中醫學“骨痹”“痿痹”等范疇，肝腎虧虛、筋骨失養為痹證之主要病因[3]。早在《內經》中就提出了“腎藏精-生髓-主骨”理論，即腎虛髓減則骨痹，腎健髓充則骨堅[4]?；谥嗅t學理論對骨痹的認識，并將“治未病”思想引入KOA的治療，以補益肝腎、活血止痹為大法，以減輕臨床癥狀、延緩病情發展[5]。丹紫康膝沖劑是湖南中醫藥大學第二附屬醫院多年治療KOA的經驗方劑，前期臨床研究發現，丹紫康膝沖劑治療KOA可以顯著改善臨床癥狀，有效預防復發，不良反應少[6]。由于其作用機制尚不明確，為其臨床推廣帶來了一定的局限性。本研究擬通過丹紫康膝沖劑干預KOA大鼠模型，以闡述丹紫康膝沖劑對延緩關節軟骨退變和軟骨下骨異常骨重建的作用及可能的分子機制，為丹紫康膝沖劑的研究和臨床開發提供可靠的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2個月齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質量200～220 g，購自湖南省中醫藥研究院實驗室，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002。飼養溫度22～25 ℃，濕度45%～65%，給予標準飼料和飲用水，飼養環境為清潔級。實驗方案得到湖南中醫藥大學第二附屬醫院實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗藥品及試劑 丹紫康膝沖劑由湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科制成成品提供，藥物組成：紫河車、丹參、熟地黃、懷牛膝、補骨脂、巴戟天、桑寄生、土鱉蟲、血竭、獨活、乳香、白芍，以上藥物由藥劑科進行煎煮并濃縮至原藥濃度3 g/mL，使用時溶于蒸餾水，根據需要配制成相應濃度懸混液。雙氯芬酸鈉腸溶片(廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字H44024989)；硫酸慶大霉素注射液(華中藥業股份有限公司，國藥準字H42021503)。試劑：TUNEL細胞凋亡試劑盒(美國Roche公司)；兔抗鼠Ⅱ型膠原多克隆抗體、兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Ⅱ型膠原C端肽(CTXⅡ)、Ⅱ型膠原C前肽(CPⅡ)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；白細胞介素1β(IL-1β)、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸劑(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗體和鼠抗人Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國CST公司)；兔抗鼠基質金屬蛋白酶3(MMP-3)多克隆抗體、兔抗鼠MMP-13多克隆抗體、兔抗鼠骨形態發生蛋白7(BMP-7)多克隆抗體(英國Abcam公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(上海譜振生物科技有限公司)；番紅-O-固綠植物組織染色液(北京雷根生物技術有限公司)；水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.3 實驗儀器 Varioskan LUX型多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Mini-PROTEAN Tetra Cell型小型垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Micro-computed tomography(Micro-CT)系統(比利時SkyScan公司)；Mimics V2.1.2三維重建系統(比利時Materialise公司)；JY-DST671實驗動物電子秤(北京金洋萬達科技有限公司)；TGL-18R型臺式冷凍離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；XSP-C204型光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；熒光顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；實驗室冰箱(北京福意電器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 KOA大鼠模型制備 大鼠適應性飼養1周，取10只大鼠設為空白組，不做任何處理，其余30只大鼠復制KOA模型。根據Hulth法[7]建立KOA模型：腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，固定在手術操作臺上，沿右側膝關節內側入路，充分暴露關節腔，切斷前交叉韌帶，經“前抽屜試驗”驗證呈陽性，則造模成功。縫合傷口。術畢，正常飼養，在傷口處涂抹硫酸慶大霉素注射液1周，以防傷口感染。術后大鼠置于3～10 ℃環境中，相對濕度保持在70%以上，每日活動6 h以上，于造模成功后4周，按照隨機數字表法分為模型組、雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組，每組10只。

1.4.2 給藥方法 丹紫康膝沖劑組予1.67 g/kg丹紫康膝沖劑灌胃，雙氯芬酸鈉組予5 mg/kg雙氯芬酸鈉灌胃，空白組、模型組均予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日灌胃1次，連續28 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 膝關節軟骨組織病理學觀察(HE染色)及病理學退變指標 大鼠用10%水合氯醛麻醉，剝取右側脛骨平臺軟骨組織，常規石蠟包埋。取石蠟包埋組織切片。分別利用二甲苯和不同濃度的乙醇溶液進行水化，HE染液染色，中性樹脂封片后，200倍鏡下觀察大鼠軟骨組織。關節軟骨損傷的嚴重程度采用改良的國際骨關節炎研究會(OARSI)評分系統[8]進行評估，具體評估病變軟骨基質丟失寬度和軟骨退變最顯著處的寬度。

1.5.2 膝關節軟骨組織病理學觀察(番紅-O-固綠組織染色) 石蠟包埋組織切片方法同1.5.1。經新鮮配置的Weigert染液染色、在固綠染色液內浸染、加入番紅O染色，中性樹脂封片后，200倍鏡下觀察大鼠軟骨組織。

1.5.3 膝關節軟骨細胞凋亡指數檢測 采用末端轉移酶介導的DIG-dUPT切口末端標記法(TUNEL)。石蠟包埋組織切片方法同1.5.1。滴加蛋白酶K工作液進行組織修復，破膜工作液破膜，去離子水洗滌3次，置于37 ℃濕盒中，依次用熒光標記的TUNEL反應液染色1 h，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染核10 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于400倍熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。凋亡指數=陽性細胞數/視野下總細胞數×100%。

1.5.4 血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平檢測 大鼠末次給藥24 h后，尾靜脈取血0.5 mL，收集血清，-80 ℃保存備用，采用ELISA法檢測。將100 μL的血清加入包被有IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ抗體的微孔中，室溫孵育1 h，采用酶標儀檢測450 nm吸收波長處的吸光光度值，并對應標準曲線計算蛋白含量。

1.5.5 膝關節軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達檢測 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)。收集新鮮的膝關節軟骨組織5 g，迅速放入預冷的研缽中搗碎，提取細胞總蛋白，取20 μg蛋白樣品進行20%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉至聚偏二氟乙烯膜上，將一抗按比例稀釋(Bcl-2 1∶2000；Bax 1∶2000；MMP-3 1∶500；MMP-13 1∶500；BMP-7 1∶500；一抗用完后回收)，分別孵育過夜，二抗孵育1 h，增強化學發光法(ECL)曝光后，對蛋白條帶進行掃描。

1.5.6 Micro-CT掃描膝關節軟骨和各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結構參數 取右側脛骨近端關節離體標本平放置于Micro-CT掃描系統的掃描槽中，沿長軸方向橫向掃描。將X射線源設置為50 kV電壓和200 μA電流，并用0.5 mm鋁過濾器過濾，掃描旋轉角度180°，增量0.5°；體素尺寸固定為8.9 μm。利用CTan軟件從三維圖像上的顯微CT數據確定骨區的形態計量指標，對骨組織進行三維圖像重建和定量分析。包括感興趣區骨體積(BV)；骨體積分數：骨體積/總體積(BV/TV)；骨小梁平均厚度(Tb.Th)；骨小梁數量(Tb.N)；體積骨密度(vBMD)；組織骨密度(tBMD)。

2 結果

2.1 各組大鼠膝關節脛骨平臺軟骨組織病理學觀察 見圖1、2。

由圖1可見，經HE染色，空白組大鼠軟骨滑膜組織完整，細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤和基質損傷或蛻變。模型組大鼠軟骨組織表面凸凹不平，軟骨表層變薄，細胞排列不規則，此外可見大量炎癥細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，而且深部軟骨細胞可見明顯細胞核壓縮，膝關節寬度和關節退變深度顯著增加。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨細胞排列均勻，胞核和胞質逐漸恢復正常。

圖1 各組大鼠膝關節脛骨平臺軟骨組織病理學觀察(HE，×200)

由圖2可見，經番紅-O-固綠染色，空白組大鼠軟骨組織染色均勻，結構清晰。模型組大鼠骨關節面不平，軟骨鈣化，膠原纖維增生，軟骨細胞外基質經番紅O染色變淺，染色不均一，而且軟骨陷窩結構擴張。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織番紅O染色稍淡染，潮線逐漸清晰，細胞排列逐漸均勻。

圖2 各組大鼠膝關節脛骨平臺軟骨組織病理學觀察(番紅-O-固綠，×200)

2.2 各組大鼠膝關節軟骨組織病理學退變指標比較 見表1。

表1 各組大鼠膝關節軟骨組織病理學退變指標比較

由表1可見，與空白組比較，模型組大鼠關節軟骨基質丟失寬度、OARSI評分、軟骨退變總寬度、軟骨退變最顯著處的寬度均增加(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠上述指標則均減少(P<0.05)；雙氯芬酸鈉組與丹紫康膝沖劑組大鼠上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡指數比較 見圖3。

由圖3可見，與空白組比較，模型組大鼠軟骨細胞凋亡指數升高(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨細胞凋亡指數降低(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組軟骨細胞凋亡指數降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠軟骨細胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平比較 見表2。

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均升高，CPⅡ水平降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均降低(P<0.05)，CPⅡ水平升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CPⅡ水平均升高(P<0.05)，CTXⅡ水平降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ、CPⅡ水平比較

2.5 各組大鼠膝關節軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達比較 見表3、圖4。

表3 各組大鼠膝關節軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達比較

圖4 各組大鼠膝關節軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3、MMP-13、BMP-7蛋白表達情況

由表3、圖4可見，經Western blot法檢測，與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表達量升高(P<0.05)，Bcl-2、BMP-7蛋白表達量降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表達量均降低(P<0.05)，Bcl-2、BMP-7蛋白表達量均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bcl-2、Bax、MMP-3蛋白表達量降低(P<0.05)，BMP-7蛋白表達量升高(P<0.05)，MMP-13蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)。

2.6 Micro-CT掃描關節軟骨和各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結構參數比較 見表4、圖5。

圖5 各組大鼠右膝關節股骨冠狀面和橫斷面Micro-CT掃描

表4 各組大鼠脛骨近端軟骨下骨微結構參數比較

由表4可見，與空白組比較，模型組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均降低(P<0.05)；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨近端軟骨下骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)。各組大鼠脛骨近端軟骨下骨tBMD組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

由圖5可見，經Micro-CT掃描，模型組大鼠脛骨近端軟骨表層可見大量基質破損或丟失，軟骨下骨骨小梁數量減少、排列紊亂并出現斷裂現象。與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨表層基質雖然也存在破損，但是最深至淺層或中層，尚未累及軟骨下骨；軟骨下骨骨小梁排列整齊，關節邊緣未見骨贅形成。

3 討論

目前，KOA的發病機制尚未完全明確，一般認為KOA是力學和生物學因素共同作用下涉及軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨結構和功能失衡的一種進行性關節疾病[9]。近年來，越來越多的基礎研究證實軟骨下骨重塑導致骨密度增高、硬化，進而導致骨小梁順應不正常應力的局部數量增加、變厚，軟骨下骨吸收應力震蕩作用減弱，從而加重關節軟骨退變的過程[10]，因此延緩軟骨組織退變和軟骨下骨異常骨重塑已成為治療KOA的重要的方法。

“腎主骨，肝主筋”，KOA發病與肝腎虧虛，風、寒、濕及瘀血客于局部有關。因此，從補益肝腎角度論治KOA不僅符合中醫理論，而且符合現代病理機制，目前已成為眾多學者臨床及實驗研究的重點內容之一[11]。丹紫康膝湯為我院治療KOA的經驗方，具有補肝益腎、活血通絡、柔肝止痛之功效[12]。方中紫河車總攬補益大效，在補益腎精的同時，又能補氣生血；丹參行血祛瘀，通絡止痛；懷牛膝補肝腎，強筋壯骨，還能行血通經；巴戟天補腎陽，祛風濕；熟地黃養陰益腎，封髓治虛；補骨脂壯腎充陽；土鱉蟲續筋接骨；乳香行氣止痛，能夠加強丹參的效用；桑寄生、獨活相須為用，祛風除濕，強筋健骨；血竭配伍白芍，活血定痛，化瘀通絡，斂陰養血。諸藥合用，標本兼顧，共奏補腎益氣、強筋壯骨、活血祛瘀、通絡止痛之功?，F代藥理研究發現，補腎類中藥有明顯延緩KOA的軟骨退變的作用，并能促進實驗性骨關節炎軟骨細胞增殖[13]；牛膝含有甾酮類(β-谷甾醇、豆甾醇)、多糖類等化合物，具有抗炎、增強免疫力、抗骨質疏松等作用[14]。丹紫康膝湯經我院數十年臨床驗證已取得較好的療效，但因湯劑存在加工復雜、不方便攜帶等不足，我院近年來一直致力該方劑型方面的研究，以沖劑作為劑型已有較深入研究，相關研究表明丹紫康膝沖劑能提高大鼠膝關節端粒酶活性，從而延緩大鼠KOA的進一步發展，其作用機制與磷酸化核轉錄因子κB抑制蛋白激酶β/核轉錄因子κB(IKKβ/NF-κB)信號傳導通路有關[15]。

前期研究顯示，丹紫康膝沖劑通過抑制由一氧化氮(NO)介導的軟骨細胞凋亡進而抑制KOA模型大鼠關節軟骨退變[16]。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的代表，Bax是促細胞凋亡蛋白的代表。本研究結果顯示，通過對KOA大鼠模型進行藥物干預，經大鼠膝關節軟骨組織病理觀察和蛋白表達檢測，與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠軟骨組織Bax蛋白表達量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量升高(P<0.05)。提示丹紫康膝沖劑可以顯著改善大鼠軟骨組織的損傷狀態和軟骨細胞凋亡。

IL-1β、IL-18、TNF-α是KOA發生、進展過程中重要的炎癥細胞因子，與軟骨下骨異常骨重建亦密切相關。Ⅱ型膠原是評價骨關節炎的重要標志物，CTXⅡ和CPⅡ作為Ⅱ型膠原降解、合成標志物，其變化可反映軟骨損傷程度[17]。有研究顯示，與非硬化區的成骨細胞相比，KOA大鼠模型硬化區軟骨下骨成骨細胞的MMP-3、MMP-13表達量顯著上調，從而促進IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥細胞因子的合成和分泌[18]。MMP-3、MMP-13均是促使Ⅱ型膠原纖維降解重要的誘導因子，MMPs蛋白表達失衡可導致軟骨細胞外基質過度降解，從而對軟骨造成進行性破壞[19-20]。BMP-7能夠調節軟骨細胞代謝，保護關節軟骨，維持軟骨組織形態[21]。本研究結果顯示，與模型組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平降低，CPⅡ水平升高(P<0.05)，軟骨組織MMP-3、MMP-13蛋白表達量降低，BMP-7蛋白表達量升高(P<0.05)。說明丹紫康膝沖劑在治療大鼠KOA過程中，具有降低炎癥細胞因子分泌、抑制Ⅱ型膠原的降解并促進其合成、減輕關節軟骨破壞和降低MMPs表達的作用。

除了軟骨下骨分子表型受到影響以外，軟骨下骨的結構和生物力學性能與KOA的進展也密切相關。作為關節最重要的應力傳導結構之一，軟骨下骨通過形變吸收應力和緩沖震蕩保護關節功能[22]。但是反復脈沖式負重可引起軟骨下骨骨小梁微骨折，因此在KOA發病早期，骨小梁多出現疏離、斷裂現象，導致軟骨下骨骨密度降低而軟骨下骨骨板處增厚，從而大大減弱了軟骨下骨緩沖應力能力，反過來可進一步加重軟骨退變。在本研究中我們通過Micro-CT成像技術證實，與空白組比較，模型組大鼠軟骨下骨骨密度降低(P<0.05)，脛骨近端軟骨表層可見大量基質破損或丟失，軟骨下骨骨小梁數量減少、排列紊亂并出現斷裂現象；與模型組大鼠比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)；與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑組大鼠脛骨BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05)。說明丹紫康膝沖劑不僅可以改善KOA發病早期階段關節軟骨下骨生物學微損傷，還可以調節其生物力學特性，從而有效阻止KOA進展過程中軟骨下骨異常骨重建和微結構改變的可能性。

綜上所述，丹紫康膝沖劑不僅能有效降低炎癥細胞因子水平和MMPs表達，減輕軟骨組織病理性損傷，同時也可以有效地改善KOA早期軟骨下骨生物力學性能和微結構改變，從而延緩KOA大鼠模型軟骨組織進行性退變和軟骨下骨異常骨重塑的發生。丹紫康膝沖劑將湯劑改良成沖劑，更加便于服用。但丹紫康膝沖劑組方用藥較多，其有效成分及具體作用機制仍需要進一步通過實驗探索證實。